電流體直寫載細(xì)胞纖維技術(shù)，直接將負(fù)載活細(xì)胞打印在定向的微尺度纖維中
時(shí)間：2021-10-15 08:00 來(lái)源：南極熊 作者：admin 閱讀：次
骨骼肌在人體的運(yùn)動(dòng)和其他動(dòng)態(tài)活動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用。為了治療關(guān)鍵的容積性肌肉缺損，現(xiàn)有研究使用自體肌肉組織植入物和手術(shù)移除壞死或受損肌肉組織以增強(qiáng)愈合潛力。然而，由于骨骼肌在生理學(xué)上具有一種肌肉纖維束和血管平行排列的結(jié)構(gòu)，由于肌纖維結(jié)構(gòu)組織和相關(guān)血管形成的可控性有限，導(dǎo)致再生效率低，傳統(tǒng)治療往往無(wú)效。
為此，來(lái)自Sungkyunkwan University的GeunHyung Kim課題組提出一種電流體直寫載細(xì)胞纖維技術(shù)，可以直接將負(fù)載的活細(xì)胞打印在定向的微尺度纖維中，誘導(dǎo)成肌細(xì)胞沿打印方向生長(zhǎng)，相關(guān)論文：Electrohydrodynamic-direct-printed cell-laden microfibrous structure using alginate-based bioink for effective myotube formation發(fā)表于Carbohydrate Polymers。
本研究展示了一種基于海藻酸鹽的生物墨水和新的生物制造方法，以獲得具有機(jī)械穩(wěn)定性和可定向的微纖維狀載細(xì)胞復(fù)合結(jié)構(gòu)，可有效地誘導(dǎo)骨骼肌組織工程，用于芯片肌肉或恢復(fù)體積肌肉缺損的結(jié)構(gòu)。
首先研究人員設(shè)計(jì)了一種帶輔助電極的噴嘴，相比單一針尖具有更均勻分布的電場(chǎng)。打印材料采用由C2C12載于成肌細(xì)胞的海藻酸鹽/PEO/纖維蛋白生物墨水組成，在合適的電直寫打印條件下噴射載細(xì)胞水凝膠并沉積在接地板上，組成設(shè)計(jì)的載細(xì)胞微纖維結(jié)構(gòu)，如圖1。
為了順利進(jìn)行電直寫打印，研究人員對(duì)不同組分的生物墨水進(jìn)行了評(píng)估，并最終確定合適的組分配比，纖維狀態(tài)穩(wěn)定并且直徑在20μm以內(nèi)，如圖2。
研究人員進(jìn)一步探索適合的打印參數(shù)，包括施加的電場(chǎng)、噴嘴距離、打印速度，各項(xiàng)參數(shù)的影響結(jié)果如圖3。最終選擇電場(chǎng)強(qiáng)度為0.15kV/mm，噴嘴距離45mm，打印速度40mm/s的參數(shù)來(lái)制備載細(xì)胞微纖維支架。
為對(duì)比電直寫載細(xì)胞纖維與傳統(tǒng)的細(xì)胞靜電紡絲，研究人員測(cè)試了生物墨水在不同電場(chǎng)強(qiáng)度下的細(xì)胞活力，如圖4。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，0.15 kV/mm的電場(chǎng)可以使細(xì)胞保持較高存活率，并且纖維成型較好，因此選擇該參數(shù)制備單軸排列的載細(xì)胞微纖維結(jié)構(gòu)。對(duì)比傳統(tǒng)細(xì)胞靜電紡絲，電直寫能更好地在指定部位沉積，減少損耗，并且由于纖維沉積密集，電直寫纖維的細(xì)胞數(shù)量明顯高于傳統(tǒng)細(xì)胞靜電紡絲。另外，在細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖率上，電直寫纖維都要優(yōu)于細(xì)胞靜電紡絲，力學(xué)性能也更接近天然肌肉特性。
研究人員進(jìn)一步對(duì)比了傳統(tǒng)擠出式生物3D打印、傳統(tǒng)細(xì)胞靜電紡絲、電直寫載細(xì)胞纖維在體外的細(xì)胞表征，結(jié)果如圖5。擠出式生物3D打印纖維上肌球蛋白重鏈（MHC）的形態(tài)是隨機(jī)的；而傳統(tǒng)細(xì)胞靜電紡絲和電直寫載細(xì)胞纖維則由于超細(xì)纖維形態(tài)而呈現(xiàn)出定向排列。但是排列的細(xì)胞只覆蓋在傳統(tǒng)靜電紡絲組的表面，而細(xì)胞在電直寫纖維上以束狀相互連接。這種有效的細(xì)胞排列可以同時(shí)具有高細(xì)胞密和適當(dāng)?shù)臋C(jī)械性能，并具有定向性能。其他的定量結(jié)果也表明電直寫載細(xì)胞纖維有利于成肌細(xì)胞的排列和分化，促進(jìn)了肌源性分化和成熟肌管。因此，研究人員使用電直寫載細(xì)胞纖維進(jìn)行C2C12成肌細(xì)胞與HUVECs的共培養(yǎng)。
接下來(lái)研究人員對(duì)HUVECs負(fù)載結(jié)構(gòu)對(duì)共培養(yǎng)結(jié)構(gòu)致肌活性的影響進(jìn)行了研究，圖6。結(jié)果證實(shí)C2C12與HUVECs共培養(yǎng)有利于肌肉組織再生。在使用C2C12和HUVECs制備復(fù)合纖維結(jié)構(gòu)之前，測(cè)試了HUVECs在電直寫工藝下的細(xì)胞活力和纖維形態(tài)(0.09-0.21 kV/mm)，根據(jù)結(jié)果，最終選擇了0.15 kV/mm的參數(shù)來(lái)制作載HUVECs的纖維結(jié)構(gòu)。
如圖7(a)所示，制備了負(fù)載HUVECs的電直寫載細(xì)胞纖維(HUVEC-EDF)，如圖7（A），這表明該制備工藝和微環(huán)境可以支持HUVECs生長(zhǎng)。然后制備了負(fù)載C2C12的纖維(C2C12- EDF)和負(fù)載C2C12/ HUVECs的復(fù)合纖維(CH-EDF)，并比較了體外細(xì)胞活性，圖7（C）。根據(jù)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果分析，由于生物物理和生化信號(hào)的協(xié)同作用，負(fù)載C2C12/ HUVECs的微纖維復(fù)合物結(jié)構(gòu)能夠高效地再生肌肉組織。
最后，為了評(píng)估肌肉缺損的再生能力，如圖8，采用電直寫載細(xì)胞纖維工藝，用脂肪干細(xì)胞(ASCs)和HUVECs構(gòu)建肌肉結(jié)構(gòu)（AH-FS）。使用GelMA和3D打印工藝作為對(duì)照，制造載ASC的常規(guī)結(jié)構(gòu)（A-CS）。經(jīng)過(guò)對(duì)比，AH-FS組顯著誘導(dǎo)肌再生，這些在體內(nèi)的結(jié)果代表了細(xì)胞負(fù)載纖維結(jié)構(gòu)治療容積性肌肉損失（VML）的潛力。
總結(jié)，該研究提出了一種新的電直寫載細(xì)胞水凝膠纖維的工藝，能夠制造高度定向的含細(xì)胞微纖維。與細(xì)胞靜電紡絲工藝不同，該方法提供了具有合理力學(xué)性能和較高細(xì)胞密度的微纖維結(jié)構(gòu)，成功實(shí)現(xiàn)了顯著的細(xì)胞生長(zhǎng)和肌源性分化。該研究揭示了一種新的電流體動(dòng)力打印的可能性，制造具有定向效果的細(xì)胞負(fù)載微纖維結(jié)構(gòu)，用于肌肉組織再生。
為此，來(lái)自Sungkyunkwan University的GeunHyung Kim課題組提出一種電流體直寫載細(xì)胞纖維技術(shù)，可以直接將負(fù)載的活細(xì)胞打印在定向的微尺度纖維中，誘導(dǎo)成肌細(xì)胞沿打印方向生長(zhǎng)，相關(guān)論文：Electrohydrodynamic-direct-printed cell-laden microfibrous structure using alginate-based bioink for effective myotube formation發(fā)表于Carbohydrate Polymers。
本研究展示了一種基于海藻酸鹽的生物墨水和新的生物制造方法，以獲得具有機(jī)械穩(wěn)定性和可定向的微纖維狀載細(xì)胞復(fù)合結(jié)構(gòu)，可有效地誘導(dǎo)骨骼肌組織工程，用于芯片肌肉或恢復(fù)體積肌肉缺損的結(jié)構(gòu)。
首先研究人員設(shè)計(jì)了一種帶輔助電極的噴嘴，相比單一針尖具有更均勻分布的電場(chǎng)。打印材料采用由C2C12載于成肌細(xì)胞的海藻酸鹽/PEO/纖維蛋白生物墨水組成，在合適的電直寫打印條件下噴射載細(xì)胞水凝膠并沉積在接地板上，組成設(shè)計(jì)的載細(xì)胞微纖維結(jié)構(gòu)，如圖1。
圖1 A）噴嘴電場(chǎng)模擬；B）載細(xì)胞電直寫凝膠纖維過(guò)程
為了順利進(jìn)行電直寫打印，研究人員對(duì)不同組分的生物墨水進(jìn)行了評(píng)估，并最終確定合適的組分配比，纖維狀態(tài)穩(wěn)定并且直徑在20μm以內(nèi)，如圖2。
圖2 混合不同纖維蛋白組分的生物墨水的各項(xiàng)性能指標(biāo)
研究人員進(jìn)一步探索適合的打印參數(shù)，包括施加的電場(chǎng)、噴嘴距離、打印速度，各項(xiàng)參數(shù)的影響結(jié)果如圖3。最終選擇電場(chǎng)強(qiáng)度為0.15kV/mm，噴嘴距離45mm，打印速度40mm/s的參數(shù)來(lái)制備載細(xì)胞微纖維支架。
圖3 各類參數(shù)下的電直寫效果
為對(duì)比電直寫載細(xì)胞纖維與傳統(tǒng)的細(xì)胞靜電紡絲，研究人員測(cè)試了生物墨水在不同電場(chǎng)強(qiáng)度下的細(xì)胞活力，如圖4。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，0.15 kV/mm的電場(chǎng)可以使細(xì)胞保持較高存活率，并且纖維成型較好，因此選擇該參數(shù)制備單軸排列的載細(xì)胞微纖維結(jié)構(gòu)。對(duì)比傳統(tǒng)細(xì)胞靜電紡絲，電直寫能更好地在指定部位沉積，減少損耗，并且由于纖維沉積密集，電直寫纖維的細(xì)胞數(shù)量明顯高于傳統(tǒng)細(xì)胞靜電紡絲。另外，在細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖率上，電直寫纖維都要優(yōu)于細(xì)胞靜電紡絲，力學(xué)性能也更接近天然肌肉特性。
圖4 電直寫細(xì)胞纖維與傳統(tǒng)細(xì)胞靜電紡絲對(duì)比。A）細(xì)胞存活率；B)掃描圖像；C)纖維直徑；D)細(xì)胞數(shù)量；E)細(xì)胞增殖率；F)力學(xué)性能
研究人員進(jìn)一步對(duì)比了傳統(tǒng)擠出式生物3D打印、傳統(tǒng)細(xì)胞靜電紡絲、電直寫載細(xì)胞纖維在體外的細(xì)胞表征，結(jié)果如圖5。擠出式生物3D打印纖維上肌球蛋白重鏈（MHC）的形態(tài)是隨機(jī)的；而傳統(tǒng)細(xì)胞靜電紡絲和電直寫載細(xì)胞纖維則由于超細(xì)纖維形態(tài)而呈現(xiàn)出定向排列。但是排列的細(xì)胞只覆蓋在傳統(tǒng)靜電紡絲組的表面，而細(xì)胞在電直寫纖維上以束狀相互連接。這種有效的細(xì)胞排列可以同時(shí)具有高細(xì)胞密和適當(dāng)?shù)臋C(jī)械性能，并具有定向性能。其他的定量結(jié)果也表明電直寫載細(xì)胞纖維有利于成肌細(xì)胞的排列和分化，促進(jìn)了肌源性分化和成熟肌管。因此，研究人員使用電直寫載細(xì)胞纖維進(jìn)行C2C12成肌細(xì)胞與HUVECs的共培養(yǎng)。
圖5 傳統(tǒng)擠出式生物3D打印、傳統(tǒng)細(xì)胞靜電紡絲、電直寫載細(xì)胞纖維在體外的生物性能表征
接下來(lái)研究人員對(duì)HUVECs負(fù)載結(jié)構(gòu)對(duì)共培養(yǎng)結(jié)構(gòu)致肌活性的影響進(jìn)行了研究，圖6。結(jié)果證實(shí)C2C12與HUVECs共培養(yǎng)有利于肌肉組織再生。在使用C2C12和HUVECs制備復(fù)合纖維結(jié)構(gòu)之前，測(cè)試了HUVECs在電直寫工藝下的細(xì)胞活力和纖維形態(tài)(0.09-0.21 kV/mm)，根據(jù)結(jié)果，最終選擇了0.15 kV/mm的參數(shù)來(lái)制作載HUVECs的纖維結(jié)構(gòu)。
圖6 (A) C2C12和HUVEC共培養(yǎng)染色圖像。(B) 共培養(yǎng)細(xì)胞的相對(duì)基因表達(dá)。(C) 0.09-0.21 kV/mm電場(chǎng)制備的HUVEC負(fù)載纖維原位活/死圖像
如圖7(a)所示，制備了負(fù)載HUVECs的電直寫載細(xì)胞纖維(HUVEC-EDF)，如圖7（A），這表明該制備工藝和微環(huán)境可以支持HUVECs生長(zhǎng)。然后制備了負(fù)載C2C12的纖維(C2C12- EDF)和負(fù)載C2C12/ HUVECs的復(fù)合纖維(CH-EDF)，并比較了體外細(xì)胞活性，圖7（C）。根據(jù)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果分析，由于生物物理和生化信號(hào)的協(xié)同作用，負(fù)載C2C12/ HUVECs的微纖維復(fù)合物結(jié)構(gòu)能夠高效地再生肌肉組織。
圖7 負(fù)載HUVECs、負(fù)載C2C12、復(fù)合纖維成肌效果對(duì)比
最后，為了評(píng)估肌肉缺損的再生能力，如圖8，采用電直寫載細(xì)胞纖維工藝，用脂肪干細(xì)胞(ASCs)和HUVECs構(gòu)建肌肉結(jié)構(gòu)（AH-FS）。使用GelMA和3D打印工藝作為對(duì)照，制造載ASC的常規(guī)結(jié)構(gòu)（A-CS）。經(jīng)過(guò)對(duì)比，AH-FS組顯著誘導(dǎo)肌再生，這些在體內(nèi)的結(jié)果代表了細(xì)胞負(fù)載纖維結(jié)構(gòu)治療容積性肌肉損失（VML）的潛力。
圖8 脛骨前肌(TA)缺損及再生結(jié)構(gòu)植入示意與對(duì)比結(jié)果
總結(jié)，該研究提出了一種新的電直寫載細(xì)胞水凝膠纖維的工藝，能夠制造高度定向的含細(xì)胞微纖維。與細(xì)胞靜電紡絲工藝不同，該方法提供了具有合理力學(xué)性能和較高細(xì)胞密度的微纖維結(jié)構(gòu)，成功實(shí)現(xiàn)了顯著的細(xì)胞生長(zhǎng)和肌源性分化。該研究揭示了一種新的電流體動(dòng)力打印的可能性，制造具有定向效果的細(xì)胞負(fù)載微纖維結(jié)構(gòu)，用于肌肉組織再生。
(責(zé)任編輯：admin)
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