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清華大學(xué)熊卓和張婷教授課題組: 功能性心肌腔室的工程化構(gòu)建最新進(jìn)展(2)

時(shí)間：2022-01-18 14:41 來源：生物打印再生工程作者：admin 閱讀：次

人類心臟中的分層血管系統(tǒng)包括動(dòng)脈、小動(dòng)脈、靜脈、小靜脈和毛細(xì)血管，直徑跨越幾個(gè)數(shù)量級(jí)。除內(nèi)皮內(nèi)層和基底膜外層外，微尺度毛細(xì)血管還稀疏地被周皮細(xì)胞覆蓋，而中尺度小動(dòng)脈和大尺度動(dòng)脈則被平滑肌細(xì)胞以及彈性蛋白和膠原纖維結(jié)合。毛細(xì)血管在大約200 μm的距離內(nèi)為實(shí)質(zhì)細(xì)胞提供有效的營(yíng)養(yǎng)和氧氣交換，而肌肉動(dòng)脈和小動(dòng)脈控制著血液的搏動(dòng)流動(dòng)(圖4a)。到目前為止，研究人員在工程組織中微血管和中尺度血管的形成方面分別取得了很大進(jìn)展(圖4b-f)。內(nèi)皮細(xì)胞可在載細(xì)胞基質(zhì)中自組裝形成微尺度毛細(xì)血管，然而它們往往難以在體外灌注并在體內(nèi)與宿主血管相吻合。生物工程方法可生成數(shù)百微米至數(shù)毫米的中尺度血管，并與宿主血管結(jié)合，然而它們不能有效地將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)輸送到周圍組織。因此，大尺度ECP的長(zhǎng)期生存需要在體外形成微、中尺度血管，模擬復(fù)雜的多尺度血管。

圖4 克服擴(kuò)散限制的血管化策略。微尺度毛細(xì)血管(b-d)和中尺度血管(e-f)的體外形成是厚心臟組織所必需的；微尺度毛細(xì)血管的體外形成依賴于內(nèi)皮細(xì)胞(EC)的自組裝，其由血管新生和血管形成驅(qū)動(dòng)(b)；微血管取向由拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)重建或力學(xué)信號(hào)調(diào)節(jié)(c)；通過吸引周皮細(xì)胞和提供合適的力學(xué)環(huán)境促進(jìn)微血管成熟(d)；單層血管的形成是通過在血管細(xì)胞存在時(shí)產(chǎn)生預(yù)先標(biāo)記的通道或在EC播種后形成的(e)；通過同軸打印和擴(kuò)散誘導(dǎo)凝膠化方法形成多層異質(zhì)血管(圖f)。

圖5 工程化心肌組織中微尺度、中尺度血管構(gòu)建方法。內(nèi)皮細(xì)胞(EC)能夠自組裝成微毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)，由內(nèi)皮細(xì)胞特異性PECAM-A(綠色)和DAPI(藍(lán)色)染色(a)；EC在VEGF梯度(紅色箭頭)下萌發(fā)成膠原支架，并用羅丹明-鬼筆環(huán)肽(黃色)和DAPI(藍(lán)色)染色。白色和無色箭頭分別表示與莖細(xì)胞相連和分離的尖端細(xì)胞(b)；機(jī)械約束條件下纖維蛋白凝膠中微毛細(xì)管取向，內(nèi)皮細(xì)胞由紅色 hCD31標(biāo)記，轉(zhuǎn)導(dǎo)周皮細(xì)胞由綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記，細(xì)胞核由藍(lán)色Hoescht標(biāo)記(c)；與GelMA水凝膠中的血管周圍細(xì)胞共培養(yǎng)促進(jìn)微毛細(xì)血管的成熟和穩(wěn)定。其中內(nèi)皮細(xì)胞由DsRed標(biāo)記，表達(dá)αSMA的平滑肌細(xì)胞從間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來(d)；通過逐層組裝具有預(yù)先設(shè)計(jì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)重建形狀的膠原水凝膠，形成可灌注血管通道。內(nèi)皮細(xì)胞用CD31(紅色)和DAPI(藍(lán)色)染色(e)；在3D打印的易流變性Pluronic F127模板上澆鑄載細(xì)胞水凝膠形成可灌注血管通道，通道內(nèi)有HUVEC(紅色)襯里，周圍組織包裹有人類新生兒真皮成纖維細(xì)胞(HNDFs，綠色)(f)；使用載有EC的犧牲生物墨水3D打印微纖維，通過犧牲打印的方法制造血管化心臟心肌補(bǔ)片，用CD31(綠色)和肌動(dòng)蛋白(粉紅色)染色(g)；通過犧牲打印策略形成血管通道，并用HUVECs(綠色)灌注(h)；用DMD立體光刻法直接制造血管化組織，HUVEC(紅色)封裝在通道中，HepG2細(xì)胞(綠色)封裝在周圍組織中(i)；利用光切除的方法在熒光素修飾的水凝膠(綠色)中生成仿生血管通道，并用熒光微珠(紅色)灌注(j)；通過同軸打印策略形成雙層血管(圖k)。

工程化心肌腔室(ECP)的成熟
一方面，雖然微智造技術(shù)特別是3D打印技術(shù)能夠精確控制細(xì)胞和生物材料的空間沉積，以創(chuàng)建腔室的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)重建形狀，但工程化心肌腔室不能自動(dòng)獲得天然心臟的功能。工程組織通常需要經(jīng)過數(shù)周或數(shù)月的體外培養(yǎng)，通過細(xì)胞黏附、組織和基質(zhì)沉積等方式完成組織形態(tài)形成和成熟。另一方面，多能干細(xì)胞的出現(xiàn)，包括胚胎干細(xì)胞(ESC)和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)，為體外產(chǎn)生心肌細(xì)胞(CM)提供了有效的細(xì)胞來源，并且具有臨床規(guī)模的高通量和高純度。然而，干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞(PSC-CM)通常是不成熟的，其結(jié)構(gòu)和功能特征類似于胎兒心肌細(xì)胞(約第十六周)，細(xì)胞和組織水平上的不成熟性已經(jīng)極大地阻礙了其在心肌再生中的應(yīng)用。例如，PSC-CM衍生的心臟心肌補(bǔ)片由于其獨(dú)立的、異質(zhì)性的收縮活動(dòng)可能改變宿主心肌的電傳播，從而導(dǎo)致致命的心律失常風(fēng)險(xiǎn)。迄今為止，通過模擬心臟發(fā)育過程中的體內(nèi)環(huán)境，已經(jīng)開發(fā)出多種策略來促進(jìn)心臟工程組織的功能成熟(圖6)。本文回顧了目前工程化心肌組織的成熟策略，并強(qiáng)調(diào)了它們?cè)诠こ袒募∏皇页墒熘械臐撛谧饔谩ｋm然目前大多數(shù)成熟策略都是通過二維培養(yǎng)模型、微尺度的類器官或心臟構(gòu)建物來證明的，但這些成熟策略與血管化策略相結(jié)合，有潛力在更大尺度上應(yīng)用于工程化心肌腔室的成熟。

圖6 模擬體內(nèi)環(huán)境的體外成熟策略。在胎兒早期，胚胎心臟長(zhǎng)成新月體，之后形成由心肌層和心內(nèi)膜層組成的心管，兩者之間有果凍狀的細(xì)胞外基質(zhì)。在胎兒晚期，心管通過折疊和旋轉(zhuǎn)成環(huán)，并在冠狀血管系統(tǒng)和傳導(dǎo)系統(tǒng)開始發(fā)育的同時(shí)轉(zhuǎn)變?yōu)榍皇倚呐K。代謝改變、細(xì)胞外基質(zhì)和非肌細(xì)胞相互作用以及機(jī)械和電刺激協(xié)同作用，促進(jìn)CM從未成熟胎兒期向完全成熟成人期發(fā)育(a)；hiPSC心源性分化能夠得到成熟程度與早期胎兒CM相當(dāng)hiPSC-CM。目前已建立了一套促進(jìn)心臟工程組織體外成熟的生物工程方法，包括長(zhǎng)期培養(yǎng)、生化誘導(dǎo)、與非肌細(xì)胞共培養(yǎng)、細(xì)胞-基質(zhì)相互作用和生物物理刺激等(b)。

展望與總結(jié)
在過去的幾年里，具有復(fù)雜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)重建特性的宏觀ECP的制備策略和微尺度ECT的成熟策略取得了顯著的進(jìn)展。隨著干細(xì)胞、生物材料和3D生物打印等技術(shù)的快速發(fā)展和融合交叉，功能性工程化心肌腔室的體外制造取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，人類有望迎來完整的人工心臟。本篇綜述討論了功能性工程化心肌腔室的一些主要挑戰(zhàn)和重要瓶頸，如與制造、血管化和成熟相關(guān)的問題。解決這些挑戰(zhàn)可以在很大程度上推進(jìn)心臟修復(fù)和心臟疾病的體外建模的技術(shù)水平。除了這些瓶頸，其他關(guān)鍵的挑戰(zhàn)包括PSC-CM的成本效益和宏觀擴(kuò)展、工程心肌與宿主心肌的電整合、宿主機(jī)體的免疫排斥、低溫保存和監(jiān)管障礙等，需要在未來的臨床轉(zhuǎn)化中加以解決。

參考文獻(xiàn)
本文第一作者為清華大學(xué)機(jī)械系生物制造中心的博士后方永聰，通訊作者為清華大學(xué)機(jī)械系生物制造中心的熊卓副教授、張婷副研究員。

Fang Y, Sun W, Zhang T, Xiong Z. Recent advances on bioengineering approaches for fabrication of functional engineered cardiac pumps: A review. Biomaterials 2022;280:121298.
https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2021.121298

(責(zé)任編輯：admin)

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