基于3D生物打印的膽管癌芯片在藥物篩選中的應用
時間：2023-04-08 09:58 來源：生物設計與制造BDM 作者：admin 閱讀：次
本研究論文聚焦基于3D生物打印的膽管癌芯片在藥物篩選中的應用。膽管癌（CCA）因為高異質性、低生存率，迫切需要開發有效的治療藥物。然而，現有的CCA藥篩模型通常無效，也是至今臨床上未有針對膽管癌有效藥物的重要原因。為此，作者基于犧牲打印和3D生物打印，構建了仿生CCA芯片模型：將膽管細胞、肝細胞和血管內皮細胞用于模型的3D生物打印，從而實現高度的空間和管狀微結構模擬，該模型在很大程度上類似于肝實質-血管-膽道系統的多細胞微環境和解剖微結構（圖1），以進行高效的抗腫瘤藥物篩選。
CCA是肝臟的原發性腫瘤，主要發生在肝外膽管腔內；60%-70%位于肝門周圍區域，約25%位于遠端導管，其余位于肝臟（圖2a）。膽管細胞、肝細胞和血管在解剖學上有著非常密切的關系，并且通常被確定參與膽管疾病的病理生理學（圖2b）。由于該疾病的復雜性，以及需要更好的體外模型來闡明CCA的發生、進展和藥物篩選，文中作者提出的CCA模型從單層2D單培養改進為精心設計的、基于3D生物打印的3D共培養芯片模型，該模型由模擬細胞外基質的水凝膠和膽管細胞、肝細胞和血管內皮細胞組成的微環境構成（圖2c-i-iii）。
作者首先利用犧牲打印，構建了3D 肝實質-血管-膽道多細胞芯片（圖3a，b），并證明了3種細胞可以在共培養體系中保持細胞活性（圖3c，d）。更有意義的是，當培養9天時，在CCA芯片模型中觀察到RBE細胞的以局部增厚的方式過度生長，產生與體內類似的膽管狹窄（圖3f），這意味著這些模型的微觀結構和微環境有利于CCA細胞仿生生長和腫瘤增生，而傳統的2D培養無法模擬這一特殊增殖現象。
為了進一步驗證3D 肝實質-血管-膽道多細胞芯片的藥篩用途，作者分別將環磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX）作用于2D和3D CCA芯片，CTX是進入人體內被肝臟或腫瘤內存在的過量的磷酰胺酶或磷酸酶水解，變為活化作用型的磷酰胺氮芥而起作用的氮芥類衍生物。CTX在體外無活性，主要通過肝臟P450酶水解成醛磷酰胺再運轉到組織中形成磷酰胺氮芥而發揮作用。結果證明，CTX對2D培養的膽管癌細胞無顯著毒性，而作用于肝實質-血管-膽道多細胞CCA芯片的CTX，顯示了劑量依賴的毒性作用（圖4c）。以上結果說明了芯片中肝細胞提供了P450對抗腫瘤前藥CTX的轉化作用，驗證了CCA芯片對抗腫瘤新藥研發的優勢性。
基于DLP的3D生物打印能夠快速選擇性地固化生物墨水，可根據具體設計實現交聯3D結構，該結構包含比犧牲生物打印更復雜的結構。作者利用該技術打印了系列膽管癌芯片，具備以下特殊結構：1. 肝細胞-血管內皮細胞-膽管癌細胞工作的肝小葉結構（圖5a，b）；2. 模擬肝臟中雙血供的血管微通道的空間解剖結構+模擬膽管樹的雙層分支導膽管結構（圖5c）；3. 互相交錯的血管-膽管結構（圖5d）。模塊尺寸為6 mm×6 mm，厚度為5 mm。微通道的直徑小至200–500 μm（圖5e）。隨后的灌注進一步證實了這些微通道的相互連接（圖5f）。這些模型表明，其與天然CCA的復雜結構（傳入血管和膽管穿過肝臟）的相似性得到了改善，并將成為未來CCA研究和篩選治療方法的合適工具。
綜上所述，該文通過犧牲或基于DLP的生物打印創建了一系列3D CCA芯片三培養模型，這些模型被證明在很大程度上模擬了天然CCA微環境與微結構，該模型代表了一種潛在的膽管癌新藥研發和個性化抗膽管癌藥物篩選方法。該文的第一作者為上海市麻醉與腦功能調控重點實驗室、同濟醫學院腦功能與人工智能轉化研究所、同濟大學附屬第四人民醫院研究員劉瓊，哈佛醫學院Y. Shrike Zhang為通訊作者。
圖1 肝實質-血管-膽道系統的多細胞微環境與微結構
CCA是肝臟的原發性腫瘤，主要發生在肝外膽管腔內；60%-70%位于肝門周圍區域，約25%位于遠端導管，其余位于肝臟（圖2a）。膽管細胞、肝細胞和血管在解剖學上有著非常密切的關系，并且通常被確定參與膽管疾病的病理生理學（圖2b）。由于該疾病的復雜性，以及需要更好的體外模型來闡明CCA的發生、進展和藥物篩選，文中作者提出的CCA模型從單層2D單培養改進為精心設計的、基于3D生物打印的3D共培養芯片模型，該模型由模擬細胞外基質的水凝膠和膽管細胞、肝細胞和血管內皮細胞組成的微環境構成（圖2c-i-iii）。
圖2 膽管癌芯片設計概況圖
作者首先利用犧牲打印，構建了3D 肝實質-血管-膽道多細胞芯片（圖3a，b），并證明了3種細胞可以在共培養體系中保持細胞活性（圖3c，d）。更有意義的是，當培養9天時，在CCA芯片模型中觀察到RBE細胞的以局部增厚的方式過度生長，產生與體內類似的膽管狹窄（圖3f），這意味著這些模型的微觀結構和微環境有利于CCA細胞仿生生長和腫瘤增生，而傳統的2D培養無法模擬這一特殊增殖現象。
圖3 肝實質-血管-膽道多細胞膽管癌芯片設計、表征與評價
為了進一步驗證3D 肝實質-血管-膽道多細胞芯片的藥篩用途，作者分別將環磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX）作用于2D和3D CCA芯片，CTX是進入人體內被肝臟或腫瘤內存在的過量的磷酰胺酶或磷酸酶水解，變為活化作用型的磷酰胺氮芥而起作用的氮芥類衍生物。CTX在體外無活性，主要通過肝臟P450酶水解成醛磷酰胺再運轉到組織中形成磷酰胺氮芥而發揮作用。結果證明，CTX對2D培養的膽管癌細胞無顯著毒性，而作用于肝實質-血管-膽道多細胞CCA芯片的CTX，顯示了劑量依賴的毒性作用（圖4c）。以上結果說明了芯片中肝細胞提供了P450對抗腫瘤前藥CTX的轉化作用，驗證了CCA芯片對抗腫瘤新藥研發的優勢性。
圖4 基于2D單細胞培養和3D膽管癌芯片模型的抗腫瘤藥物篩選應用
基于DLP的3D生物打印能夠快速選擇性地固化生物墨水，可根據具體設計實現交聯3D結構，該結構包含比犧牲生物打印更復雜的結構。作者利用該技術打印了系列膽管癌芯片，具備以下特殊結構：1. 肝細胞-血管內皮細胞-膽管癌細胞工作的肝小葉結構（圖5a，b）；2. 模擬肝臟中雙血供的血管微通道的空間解剖結構+模擬膽管樹的雙層分支導膽管結構（圖5c）；3. 互相交錯的血管-膽管結構（圖5d）。模塊尺寸為6 mm×6 mm，厚度為5 mm。微通道的直徑小至200–500 μm（圖5e）。隨后的灌注進一步證實了這些微通道的相互連接（圖5f）。這些模型表明，其與天然CCA的復雜結構（傳入血管和膽管穿過肝臟）的相似性得到了改善，并將成為未來CCA研究和篩選治療方法的合適工具。
圖5 基于DLP 3D生物打印技術的結構復雜的仿生CCA芯片
綜上所述，該文通過犧牲或基于DLP的生物打印創建了一系列3D CCA芯片三培養模型，這些模型被證明在很大程度上模擬了天然CCA微環境與微結構，該模型代表了一種潛在的膽管癌新藥研發和個性化抗膽管癌藥物篩選方法。該文的第一作者為上海市麻醉與腦功能調控重點實驗室、同濟醫學院腦功能與人工智能轉化研究所、同濟大學附屬第四人民醫院研究員劉瓊，哈佛醫學院Y. Shrike Zhang為通訊作者。
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