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雙水相嵌入(生物)3D打印構(gòu)建無(wú)海藻酸、獨(dú)立、可灌注的超細(xì)和超薄壁管狀結(jié)構(gòu)

時(shí)間:2023-02-09 15:48 來(lái)源:南極熊 作者:admin 閱讀:
      目前,生物工程纖維、血管在再生醫(yī)學(xué)和藥物篩選等應(yīng)用中的需求越來(lái)越大,但生物工程纖維、血管移植物的真正可用性仍然非常有限。近些年,3D生物打印技術(shù)為移植和再生提供了一種潛在的纖維、血管或血管化組織結(jié)構(gòu)的制備方法,盡管在3D生物打印方面相對(duì)較大尺寸的纖維、類血管的制備取得了一定的成功,但具有超細(xì)直徑纖維或具有超薄壁的類血管結(jié)構(gòu)的制造仍然是一項(xiàng)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。最近,哈佛大學(xué)Y. Shrike Zhang教授課題組對(duì)這一重要問(wèn)題進(jìn)行了深入系統(tǒng)的研究,提出了一種利用雙水相嵌入3D生物打印策略打印纖維或管狀結(jié)構(gòu)。該策略采用高度生物可相容的生物水凝膠,利用互不相容的雙水相設(shè)計(jì),打印過(guò)程中不再需要借助海藻酸鈉水性體系結(jié)構(gòu),不僅如此,該體系允許生物墨水在不混溶的水性支撐浴中自由構(gòu)筑微纖維和管狀結(jié)構(gòu)。該打印策略具有極限制造能力,可以打印直徑為3 μm的固體纖維或直徑為40 μm、壁厚低至5 μm的管狀結(jié)構(gòu)。通過(guò)進(jìn)一步接種內(nèi)皮細(xì)胞驗(yàn)證了該策略所構(gòu)建微血管結(jié)構(gòu)可以作為內(nèi)皮細(xì)胞的有效載體,并驗(yàn)證了部分功能化和血管萌芽等。該策略將作為一個(gè)平臺(tái),可以滿足未來(lái)不同類型的潛在生物醫(yī)學(xué)和其他應(yīng)用的需求,特別是與用于再生醫(yī)學(xué)和組織模型工程的超小直徑和超薄壁的管狀組織有關(guān)的應(yīng)用。
圖 1. 通過(guò)雙水相嵌入(生物)打印策略,打印無(wú)海藻酸、獨(dú)立、可灌注的超細(xì)和超薄壁管狀結(jié)構(gòu)打印過(guò)程示意圖。

研究者提出的雙水相水下嵌入打印策略結(jié)合了雙水相和同軸微流體生物打印技術(shù),主要基于一種可光交聯(lián)的甲基丙烯酰化明膠(GelMA)作為水性生物墨水,以及聚氧化乙烯 (PEO)作為水性支持浴。在一定濃度下,GelMA和PEO在形成的雙水相系統(tǒng)中不相混溶,當(dāng)調(diào)整兩個(gè)水相的參數(shù)時(shí),GelMA 生物墨水可以以嵌入的方式直接擠出到PEO支持浴中,打印形成穩(wěn)定的3D圖案。生物墨水不僅限于GelMA, 還包括透明質(zhì)酸等。
圖2. 優(yōu)化、調(diào)節(jié)打印參數(shù),使打印纖維能獲得更大范圍的尺寸可調(diào)節(jié)性。

使用此生物打印策略,通過(guò)調(diào)節(jié)噴嘴直徑、墨水流量和打印噴頭移動(dòng)速度等打印參數(shù),可以制備直徑在10-700 μm之間的GelMA固體纖維(圖2 A),這表明打印GelMA纖維具有簡(jiǎn)便性和強(qiáng)大的尺寸可調(diào)性。除了使用金屬針作為噴嘴外,研究者還采用了玻璃毛細(xì)管來(lái)打印超細(xì)纖維,通過(guò)毛細(xì)管打印能夠進(jìn)一步優(yōu)化GelMA纖維直徑范圍,可以制備從3 μm到60 μm的纖維(圖2 B),這有利于進(jìn)一步擴(kuò)展組織生物制造的應(yīng)用,因?yàn)橥ǔG闆r下,均質(zhì)水凝膠或顆粒狀水凝膠被用作水下擠出打印的支持浴時(shí),由于機(jī)械阻力較高通常無(wú)法順利移動(dòng)和打印出超細(xì)的纖維,而利用研究者提出的打印策略,玻璃毛細(xì)管可以在PEO為主體的水溶液支持浴中順利移動(dòng)和打印(圖2 C-i)。此外,研究者展示了自制的、具有漸變尖端的超細(xì)玻璃毛細(xì)管也可以很容易地在PEO為主體的支持浴中從一側(cè)轉(zhuǎn)移到另一側(cè)(圖2 C-ii 上)。然而,在相同條件下,當(dāng)使用凝膠支持浴時(shí),沿毛細(xì)管路徑的大量氣泡被引入凝膠浴系統(tǒng)(圖2 C-ii下)。總的來(lái)講,雙水相嵌入打印策略克服了迄今為止水下生物打印的一個(gè)普遍挑戰(zhàn)。使用雙水相策略與機(jī)械擠壓方法相結(jié)合的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于,它不僅允許重復(fù)修改打印圖案,在使用動(dòng)態(tài)配置的梯度濃度溶液作為支持浴時(shí),還可以進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)形狀可重構(gòu)的四維(4D)打印。

圖3. 表面化學(xué)交聯(lián)誘導(dǎo)中空管狀纖維的形成。

此外,由于研究人員能夠?qū)崿F(xiàn)在如上所述的PEO支持浴中直接打印GelMA纖維,他們?cè)O(shè)想通過(guò)表面交聯(lián)方法制備壁厚可調(diào)節(jié)的中空管狀纖維結(jié)構(gòu)。基于此,研究者們創(chuàng)新性的提出采用微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(MTG)作為表面化學(xué)交聯(lián)劑,通過(guò)四個(gè)步驟在PEO收集浴中生成管狀結(jié)構(gòu)(圖3 A)。通過(guò)控制MTG交聯(lián)時(shí)間,能夠精確地調(diào)整管狀結(jié)構(gòu)的壁厚從10 μm到100 μm不等,直至形成固體水凝膠纖維(圖3 B)。
圖4. 同軸打印基于GelMA的管狀結(jié)構(gòu)。

傳統(tǒng)同軸濕紡已被廣泛用于高通量制備中空管狀結(jié)構(gòu),基于此,同軸微流體生物打印方法也可以實(shí)現(xiàn)灌注管狀結(jié)構(gòu)圖案的3D打印,正如研究者先前所報(bào)道的部分工作(Advanced Materials, 2018, 30, 1706913;Science Advances, 2022, 8, eabq6900)。然而,同軸擠壓策略有兩個(gè)關(guān)鍵限制。首先,它通常需要在海藻酸鈉的存在下進(jìn)行,海藻酸鈉是一種可以通過(guò)二價(jià)陽(yáng)離子(如Ca2+)物理交聯(lián)的生物材料,以確保擠出過(guò)程中的快速成型。因此,海藻酸鈉必須單獨(dú)或混合作為生物墨水中的一種成分。一般情況下,除非經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾或制備后犧牲掉,否則海藻酸鈉會(huì)限制細(xì)胞生長(zhǎng)和伸展。盡管研究者最近證明,通過(guò)將明膠復(fù)合生物墨水?dāng)D出到冰水支持浴中可以制備不包括海藻酸鈉的管狀結(jié)構(gòu)(ACS Biomaterials Science & Engineering, 2019, 5, 5514),但這無(wú)法解決第二個(gè)挑戰(zhàn)。通常,同軸擠出的管狀纖維的直徑和壁厚保持在相對(duì)較大的尺寸上,所制備管狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)徑無(wú)法輕易低于100 μm,壁厚最小為幾十微米。即使研究者在之前的工作中提出了收縮打印法將內(nèi)徑減小到低于50 μm(Nature Communications, 2020, 11, 1267),但管壁厚度還是無(wú)法低于50 μm。毫無(wú)疑問(wèn),進(jìn)一步減小管狀結(jié)構(gòu)內(nèi)徑和控制壁厚小于50 μm仍是一項(xiàng)巨大的挑戰(zhàn)。為此,研究人員通過(guò)利用所提出的雙水相嵌入同軸打印策略,證明了極大范圍地調(diào)節(jié)管狀結(jié)構(gòu)直徑和壁厚的可行性。研究者使用自制的雙層同軸噴嘴,其中GelMA從殼層輸送,而PEO從芯層共同輸送到水性PEO支撐浴中,最終使用光交聯(lián)固化后形成GelMA水凝膠管狀結(jié)構(gòu)(圖4 A)。進(jìn)一步,可以輕易地通過(guò)改變水凝膠的流量、打印噴頭的移動(dòng)速度等來(lái)調(diào)節(jié)管狀結(jié)構(gòu)直徑和壁厚。研究表明,使用該同軸噴嘴可以獲得傳統(tǒng)的同軸濕法或生物打印設(shè)備中不可能實(shí)現(xiàn)的管狀結(jié)構(gòu)尺寸,例如內(nèi)徑最小可達(dá)37 μm、而壁厚最小可達(dá)4 μm(圖4 B-E)。此外,為了說(shuō)明超薄管壁的實(shí)際應(yīng)用,研究者制備了不同壁厚的管狀結(jié)構(gòu)。使用自制的灌流裝置分析了攜氧紅細(xì)胞在管狀結(jié)構(gòu)中氧氣的擴(kuò)散情況,結(jié)果表明,具有超薄壁特征的管狀結(jié)構(gòu)可以加速氧氣的擴(kuò)散,這也將適用于其他生物分子。這顯示出了雙水相水下嵌入同軸打印策略比傳統(tǒng)同軸法打印的壁厚更能模擬毛細(xì)血管或小血管的物質(zhì)傳輸。同時(shí),研究者也進(jìn)一步打印了由管狀纖維組成的復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)(圖4 F),這表明該打印策略能夠完成復(fù)雜的3D結(jié)構(gòu)的打印,利用該方法研究人員也成功打印了血管化的腫瘤組織模型。

圖5. 同軸打印的管狀結(jié)構(gòu)內(nèi)的細(xì)胞行為。

研究者隨后開(kāi)始評(píng)估雙水相水下嵌入打印策略的細(xì)胞相容性。研究者設(shè)計(jì)了一種微流控芯片裝置,將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)接種到管腔內(nèi)。細(xì)胞在接種后逐漸從圓形開(kāi)始伸展,最后形成紡錘形(圖5 A)。培養(yǎng)7天后,細(xì)胞活力高達(dá)98%(圖5 A,圖5 B-i)。在7天的培養(yǎng)過(guò)程中,HUVECs保持了很強(qiáng)的代謝活性,細(xì)胞鋪展面積逐漸增加(圖5 B-ii 和 iii)。 通過(guò)肌動(dòng)蛋白染色,可以觀察到培養(yǎng)第1天,細(xì)胞分布均勻,貼壁緊密,細(xì)胞生長(zhǎng)和重組明顯,在第7天后形成覆蓋整個(gè)管腔內(nèi)表面的致密單層結(jié)構(gòu)(圖5 C和D)。并且,在培養(yǎng)期間,內(nèi)皮細(xì)胞在管狀結(jié)構(gòu)內(nèi)表達(dá)出了明顯的人緊密連接蛋白1(ZO-1,圖5 E)。研究人員為了證明無(wú)海藻酸鈉引入的優(yōu)勢(shì),利用GelMA管狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行了萌芽誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn),結(jié)果證明與基于藻酸鈉的管狀結(jié)構(gòu)不同,只有GelMA組成的管狀結(jié)構(gòu)很容易地被內(nèi)皮細(xì)胞重塑、形成萌芽和多尺度血管化。這些結(jié)果表明,雙水相水下嵌入打印策略制備的工程血管具有很好的細(xì)胞相容性,有利于內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、伸展、功能化和多尺度血管化的實(shí)現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,研究人員分別使用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和腎臟近曲小管上皮細(xì)胞進(jìn)行了驗(yàn)證。

圖6. 同軸打印的管狀組織的寬尺寸可調(diào)整性。

具有大范圍可調(diào)節(jié)的工程血管是成功復(fù)制血管結(jié)構(gòu)和功能以用于轉(zhuǎn)化應(yīng)用的重要一步。傳統(tǒng)的同軸微流體生物打印通常不允許形成具有超細(xì)直徑或超薄壁的血管導(dǎo)管。研究者成功地在管狀結(jié)構(gòu)(直徑從40到2000 μm,相應(yīng)的壁厚從5到500 μm)的內(nèi)腔表面接種了內(nèi)皮細(xì)胞(圖6),初步證明雙水相水下嵌入(生物)打印策略具有靈活性,可以實(shí)現(xiàn)制備大范圍、可調(diào)節(jié)的類血管結(jié)構(gòu)。該打印策略打印的管狀組織尺寸接近或完全覆蓋人體血管尺寸,為滿足不同類型應(yīng)用的需求提供了可能性,特別是對(duì)于具有非常小直徑和壁厚的血管尺寸的應(yīng)用。

以上相關(guān)成果以 “Liquid-Embedded (Bio)printing of Alginate-Free, Standalone, Ultra-Fine, and Ultra-Thin-Walled Cannular Structures” 為題發(fā)表在《PNAS》上。文章通訊作者為Y. Shrike Zhang教授。文章第一作者為唐國(guó)勝(Guosheng Tang)教授,哈佛大學(xué)聯(lián)培博士、博士后。論文共同第一作者為哈佛醫(yī)學(xué)院Dr. Zeyu Luo、Dr. Liming Lian,其它作者還包括哈佛醫(yī)學(xué)院Dr. Jie Guo、Dr. Sushila Maharjan、Carlos Ezio Garciamendez-Mijares、Prof. Mian Wang、Prof. Wanlu Li、Zhenrui Zhang、Dr. Di Wang、Prof. Maobin Xie、Prof. Hossein Ravanbakhsh、Dr. Cuiping Zhou、Dr. Xiao Kuang 和廣州醫(yī)科大學(xué)Dr. Yingying Hou、Prof. Xiyong Yu等。

原文鏈接:
https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2206762120

(責(zé)任編輯:admin)

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