《AHM》：3D打印為患者定制“一對一”個性化siRNA療法
時間：2023-10-07 16:56 來源：南極熊 作者：EngineeringForLife 閱讀：次
合成的雙鏈小干擾RNA（siRNA）是開發基因沉默治療的一個潛在候選藥物。由于siRNA療法的藥代動力學不佳，其方法的開發和臨床轉化仍然具有挑戰性。3D打印技術為局部和持續傳遞siRNA制造個性化植入物提供很好的機會。水凝膠可以模擬組織的力學性能，避免與剛性植入物相關的問題。為此，來自德國萊比錫大學的Michaela
Schulz-Siegmund及其團隊制備一種適合于擠出3D打印的熱響應復合水凝膠，以制造裝載siRNA脂質體RNAiMAXTM復合物的控釋植入物。本研究選擇一種主要由不帶電的瓊脂糖組成的水凝膠基質來保護siRNA免于解絡。此外，添加多個F127和明膠，以提高打印性、降解性和細胞對瓊脂糖植入物的粘附。為了避免siRNA在打印過程中暴露于熱應力下，為植入物建立了一個核心和殼設計，其中一個siRNA復合物的核心在沒有加熱的情況下打印，并與一個由熱響應復合水凝膠組成的外殼包圍。通過改變打印模式來控制siRNA復合物的釋放譜。本研究結果顯示，植入物可以維持釋放siRNA
1個月。本研究證明了釋放的siRNA復合物直到第8天依然具有完整性。
相關研究內容以“Fabrication of 3D Printed, Core-and-Shell Implants as Controlled Release Systems for local siRNA Delivery”為題于2023年9月15日發表在《Advanced Healthcare Materials》。
不同成分復合水凝膠的流變圖如圖1所示。為了設置打印條件，將每個復合水凝膠的溶膠-凝膠轉變溫度記錄為存儲和損失模量曲線之間的交叉點（圖1A中箭頭處）。圖1B顯示當將形成的凝膠的溫度從20℃提高到60℃時，存儲模量和損耗模量之間沒有交叉。
瓊脂糖、PF127、明膠和復合水凝膠的熱圖如圖2所示。PF127在57℃處出現一個與其熔化溫度對應的吸熱尖峰。熔化峰也出現在含有3%瓊脂糖的復合水凝膠的所有熱圖中，表明PF127仍處于結晶狀態。在含有5%瓊脂糖的復合水凝膠中，沒有PF127的熔化峰，表明PF127已經轉化為非定形形式，賦予系統更高的靈活性。瓊脂糖濃度依賴性的PF127結晶度的降低可能歸因于瓊脂糖對PF127的塑化，表明兩種聚合物之間可能存在分子間相互作用。含5%瓊脂糖的復合水凝膠比3%瓊脂糖水凝膠更適合打印系統。
對于PF127粉末，1342和1360 cm-1處的兩個帶對應于甲烯組的擺動(ω)振動，1241和1279 cm-1處的兩個帶對應于扭轉振動（圖3A）。在1060、1099和1146 cm-1處，C-O-C的拉伸(ν)振動可以視為三個主要條帶（圖3B）。在961處觀察到的峰值對應于甲烯組的搖擺(ρ)（圖3C）。在增加瓊脂糖濃度或明膠濃度時，甲烯和甲烯剪切(δ)振動的2881（圖3D）和1466cm-1（圖3E）的消失也證實PF127以水合而非定形的形式存在。在圖3F中可以觀察到931和771 cm-1處的3，6-無氫半乳糖彎曲帶，以及β-半乳糖單元在881 cm-1處的C-H彎曲振動，以及1037 cm-1處的C-O的拉伸振動帶。在1519 cm-1處，所有水凝膠復合材料的N-H波段強度均有所下降（圖3G），揭示明膠的N-H基團在復合水凝膠中存在相互作用。FTIR結果證實了PF127、明膠和瓊脂糖之間的相互作用。
本研究在水凝膠配方中加入少量的凝膠（0.25%和0.5% W/W），以提高細胞對瓊脂糖/PF127復合水凝膠的粘附性。圖4顯示在水凝膠上生長的L929成纖維細胞的顯微圖像，顯示L929細胞在含0.5%明膠配制的水凝膠上密度更密集，而在不含或只含0.25%明膠的水凝膠上生長的細胞更少。
在低進料速率下，獲得了厚度不均勻的細絲（圖5A、B）。圖5C描述了30%（w/w）PF127的擠壓細絲。此外，熒光標記的AF488siRNA-脂質體RNAiMAX復合物可以均勻地裝載在PF127核心墨水中（圖5D）。Design2由空間為0.4 mm的5層線，空間為0.8mm的3層線，空間為0.5 mm的2層線組成，排列順序如圖5E所示。Design3和Design4僅制作了6層，但它們的線間距不同，Design3的4層為0.4 mm，2層為0.7 mm，Design4的6層為0.4 mm（圖5E）。
圖6顯示所有的種植體都具有較高的腫脹特性。種植體在緩沖液中的腫脹普遍高于水中。種植體Design3在緩沖液中加入30 min后腫脹指數最高。1h后，種植體Design3的腫脹指數仍顯著高于Design1，說明更寬的打印模式和更少層數的Design3促進植入物內水的快速擴散，從而快速膨脹。種植體Design4在所有時間點的腫脹指數均比Design1高，意味著水對10層植入物的侵入需要更長的時間。用H-N緩沖液提取植入體后，植入體Design1、2、3和4的質量百分圖如圖6D所示，種植體Design3在所有研究設計中質量損失率最高，其次分別是Design4、2和1。
siRNA復合物的釋放譜如圖7a所示，結果顯示，3D打印植入物可以成功地維持siRNA復合物的釋放超過30天。在Design1、2、4和3中，Design3在30天內累計釋放的siRNA%的復合物速度最快。與在凝膠中遷移的游離siRNA樣品相比，釋放的siRNA樣品的條帶在瓊脂糖凝膠中沒有遷移（圖7B），表明釋放的siRNA樣品保持復雜形式，沒有檢測到游離siRNA。
為了研究釋放的siRNA是否仍然具有功能，再次測試CD siRNA作為一種模型癌細胞對SAOS-2細胞的影響。本研究開發了一種特殊的細胞培養裝置，其中植入物每隔一天從孔移動到孔，而植入物不直接與細胞接觸。這是通過一個支持的瓊脂糖環來實現的，允許將植入物放置在細胞的上方，因此細胞可以用釋放的siRNA復合物來處理（圖8）。SAOS-2細胞在與細胞殺傷siRNA植入物孵育后的活力被用來作為釋放復合物功能的指示指標。將細胞（3×104）接種于12個孔板中，將200μL 6%瓊脂糖溶液鑄造在孔壁上形成環，以防止細胞與植入物之間的物理接觸（圖8）。
實驗采用Design 4和Design 2的植入物進行。SAOS-2細胞處理后的存活率如圖9所示。在植入物Design 4中，在所有時間點，CD siRNA處理的細胞的活力都低于NC siRNA植入物處理的細胞（圖9A）。在植入物Design 2中，CD siRNA植入物處理的細胞的存活率似乎都低于NC siRNA植入物處理的細胞（圖9B）。
總之，本研究的目的是制造一個3D打印的“核殼”植入物，用于局部傳遞siRNA。在此提出了3D打印技術作為一種簡單的自動制造策略，以提供植入siRNA的治療。3D打印可以根據每個患者的需要進行定制不同的形狀和尺寸。此外，本研究提出了水凝膠復合物作為外殼材料，因為水凝膠植入物比剛性聚合物植入物更有利。用瓊脂糖、PF127和明膠制備復合水凝膠，其成分分別為5、3、0.5%。PF127在水凝膠中與瓊脂糖基質相互作用，轉化為無定形形式。由于明膠含量，水凝膠具有良好的熱響應特性，因此被用于3D打印，以制造控釋植入物，用于局部個性化siRNA治療（例如在切除的腫瘤腔內）。利用制備的復合瓊脂糖、PF127和明膠水凝膠進行3D打印，打印包含siRNA裝載的多核外殼，以賦予植入物的機械強度，并控制siRNA復合物從核心的釋放。通過改變植入物設計的打印模式，成功地控制siRNA復合物的釋放譜，從而獲得更快或持續的釋放譜。本研究中的3D打印植入物為個性化siRNA治療提供了一個很有前景的傳遞系統。總的來說，本研究提出的3D打印植入物代表一種RNA傳遞系統，可用于各種疾病的治療，或作為用于組織工程目的的細胞游離RNA負載系統。
文章來源：
https://doi.org/10.1002/adhm.202301643
相關研究內容以“Fabrication of 3D Printed, Core-and-Shell Implants as Controlled Release Systems for local siRNA Delivery”為題于2023年9月15日發表在《Advanced Healthcare Materials》。
圖1 復合水凝膠的流變學評價
不同成分復合水凝膠的流變圖如圖1所示。為了設置打印條件，將每個復合水凝膠的溶膠-凝膠轉變溫度記錄為存儲和損失模量曲線之間的交叉點（圖1A中箭頭處）。圖1B顯示當將形成的凝膠的溫度從20℃提高到60℃時，存儲模量和損耗模量之間沒有交叉。
圖2 瓊脂糖、PF127、明膠和復合水凝膠的差示掃描量熱法（DSC）熱圖
瓊脂糖、PF127、明膠和復合水凝膠的熱圖如圖2所示。PF127在57℃處出現一個與其熔化溫度對應的吸熱尖峰。熔化峰也出現在含有3%瓊脂糖的復合水凝膠的所有熱圖中，表明PF127仍處于結晶狀態。在含有5%瓊脂糖的復合水凝膠中，沒有PF127的熔化峰，表明PF127已經轉化為非定形形式，賦予系統更高的靈活性。瓊脂糖濃度依賴性的PF127結晶度的降低可能歸因于瓊脂糖對PF127的塑化，表明兩種聚合物之間可能存在分子間相互作用。含5%瓊脂糖的復合水凝膠比3%瓊脂糖水凝膠更適合打印系統。
圖3 復合水凝膠的FTIR光譜
對于PF127粉末，1342和1360 cm-1處的兩個帶對應于甲烯組的擺動(ω)振動，1241和1279 cm-1處的兩個帶對應于扭轉振動（圖3A）。在1060、1099和1146 cm-1處，C-O-C的拉伸(ν)振動可以視為三個主要條帶（圖3B）。在961處觀察到的峰值對應于甲烯組的搖擺(ρ)（圖3C）。在增加瓊脂糖濃度或明膠濃度時，甲烯和甲烯剪切(δ)振動的2881（圖3D）和1466cm-1（圖3E）的消失也證實PF127以水合而非定形的形式存在。在圖3F中可以觀察到931和771 cm-1處的3，6-無氫半乳糖彎曲帶，以及β-半乳糖單元在881 cm-1處的C-H彎曲振動，以及1037 cm-1處的C-O的拉伸振動帶。在1519 cm-1處，所有水凝膠復合材料的N-H波段強度均有所下降（圖3G），揭示明膠的N-H基團在復合水凝膠中存在相互作用。FTIR結果證實了PF127、明膠和瓊脂糖之間的相互作用。
圖4 L929細胞生長6天后的情況
本研究在水凝膠配方中加入少量的凝膠（0.25%和0.5% W/W），以提高細胞對瓊脂糖/PF127復合水凝膠的粘附性。圖4顯示在水凝膠上生長的L929成纖維細胞的顯微圖像，顯示L929細胞在含0.5%明膠配制的水凝膠上密度更密集，而在不含或只含0.25%明膠的水凝膠上生長的細胞更少。
圖5 PF127芯墨的可打印性和打印組裝好的植入物
在低進料速率下，獲得了厚度不均勻的細絲（圖5A、B）。圖5C描述了30%（w/w）PF127的擠壓細絲。此外，熒光標記的AF488siRNA-脂質體RNAiMAX復合物可以均勻地裝載在PF127核心墨水中（圖5D）。Design2由空間為0.4 mm的5層線，空間為0.8mm的3層線，空間為0.5 mm的2層線組成，排列順序如圖5E所示。Design3和Design4僅制作了6層，但它們的線間距不同，Design3的4層為0.4 mm，2層為0.7 mm，Design4的6層為0.4 mm（圖5E）。
圖6 種植體的腫脹指數
圖6顯示所有的種植體都具有較高的腫脹特性。種植體在緩沖液中的腫脹普遍高于水中。種植體Design3在緩沖液中加入30 min后腫脹指數最高。1h后，種植體Design3的腫脹指數仍顯著高于Design1，說明更寬的打印模式和更少層數的Design3促進植入物內水的快速擴散，從而快速膨脹。種植體Design4在所有時間點的腫脹指數均比Design1高，意味著水對10層植入物的侵入需要更長的時間。用H-N緩沖液提取植入體后，植入體Design1、2、3和4的質量百分圖如圖6D所示，種植體Design3在所有研究設計中質量損失率最高，其次分別是Design4、2和1。
圖7 從3D打印植入物中提取siRNA的體外釋放研究
siRNA復合物的釋放譜如圖7a所示，結果顯示，3D打印植入物可以成功地維持siRNA復合物的釋放超過30天。在Design1、2、4和3中，Design3在30天內累計釋放的siRNA%的復合物速度最快。與在凝膠中遷移的游離siRNA樣品相比，釋放的siRNA樣品的條帶在瓊脂糖凝膠中沒有遷移（圖7B），表明釋放的siRNA樣品保持復雜形式，沒有檢測到游離siRNA。
圖8 瓊脂糖環的設計和在細胞活力實驗中用于研究從植入物中釋放的siRNA復合物的作用的程序示意圖
為了研究釋放的siRNA是否仍然具有功能，再次測試CD siRNA作為一種模型癌細胞對SAOS-2細胞的影響。本研究開發了一種特殊的細胞培養裝置，其中植入物每隔一天從孔移動到孔，而植入物不直接與細胞接觸。這是通過一個支持的瓊脂糖環來實現的，允許將植入物放置在細胞的上方，因此細胞可以用釋放的siRNA復合物來處理（圖8）。SAOS-2細胞在與細胞殺傷siRNA植入物孵育后的活力被用來作為釋放復合物功能的指示指標。將細胞（3×104）接種于12個孔板中，將200μL 6%瓊脂糖溶液鑄造在孔壁上形成環，以防止細胞與植入物之間的物理接觸（圖8）。
圖9 用3D打印植入物 Design 4和Design 2處理后的SAOS-2細胞活力
實驗采用Design 4和Design 2的植入物進行。SAOS-2細胞處理后的存活率如圖9所示。在植入物Design 4中，在所有時間點，CD siRNA處理的細胞的活力都低于NC siRNA植入物處理的細胞（圖9A）。在植入物Design 2中，CD siRNA植入物處理的細胞的存活率似乎都低于NC siRNA植入物處理的細胞（圖9B）。
總之，本研究的目的是制造一個3D打印的“核殼”植入物，用于局部傳遞siRNA。在此提出了3D打印技術作為一種簡單的自動制造策略，以提供植入siRNA的治療。3D打印可以根據每個患者的需要進行定制不同的形狀和尺寸。此外，本研究提出了水凝膠復合物作為外殼材料，因為水凝膠植入物比剛性聚合物植入物更有利。用瓊脂糖、PF127和明膠制備復合水凝膠，其成分分別為5、3、0.5%。PF127在水凝膠中與瓊脂糖基質相互作用，轉化為無定形形式。由于明膠含量，水凝膠具有良好的熱響應特性，因此被用于3D打印，以制造控釋植入物，用于局部個性化siRNA治療（例如在切除的腫瘤腔內）。利用制備的復合瓊脂糖、PF127和明膠水凝膠進行3D打印，打印包含siRNA裝載的多核外殼，以賦予植入物的機械強度，并控制siRNA復合物從核心的釋放。通過改變植入物設計的打印模式，成功地控制siRNA復合物的釋放譜，從而獲得更快或持續的釋放譜。本研究中的3D打印植入物為個性化siRNA治療提供了一個很有前景的傳遞系統。總的來說，本研究提出的3D打印植入物代表一種RNA傳遞系統，可用于各種疾病的治療，或作為用于組織工程目的的細胞游離RNA負載系統。
文章來源：
https://doi.org/10.1002/adhm.202301643
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