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《AHM》:3D打印為患者定制“一對一”個性化siRNA療法

時間:2023-10-07 16:56 來源:南極熊 作者:EngineeringForLife 閱讀:
         合成的雙鏈小干擾RNA(siRNA)是開發基因沉默治療的一個潛在候選藥物。由于siRNA療法的藥代動力學不佳,其方法的開發和臨床轉化仍然具有挑戰性。3D打印技術為局部和持續傳遞siRNA制造個性化植入物提供很好的機會。水凝膠可以模擬組織的力學性能,避免與剛性植入物相關的問題。為此,來自德國萊比錫大學的Michaela Schulz-Siegmund及其團隊制備一種適合于擠出3D打印的熱響應復合水凝膠,以制造裝載siRNA脂質體RNAiMAXTM復合物的控釋植入物。本研究選擇一種主要由不帶電的瓊脂糖組成的水凝膠基質來保護siRNA免于解絡。此外,添加多個F127和明膠,以提高打印性、降解性和細胞對瓊脂糖植入物的粘附。為了避免siRNA在打印過程中暴露于熱應力下,為植入物建立了一個核心和殼設計,其中一個siRNA復合物的核心在沒有加熱的情況下打印,并與一個由熱響應復合水凝膠組成的外殼包圍。通過改變打印模式來控制siRNA復合物的釋放譜。本研究結果顯示,植入物可以維持釋放siRNA 1個月。本研究證明了釋放的siRNA復合物直到第8天依然具有完整性。
        相關研究內容以“Fabrication of 3D Printed, Core-and-Shell Implants as Controlled Release Systems for local siRNA Delivery”為題于2023年9月15日發表在《Advanced Healthcare Materials》。

圖1 復合水凝膠的流變學評價

不同成分復合水凝膠的流變圖如圖1所示。為了設置打印條件,將每個復合水凝膠的溶膠-凝膠轉變溫度記錄為存儲和損失模量曲線之間的交叉點(圖1A中箭頭處)。圖1B顯示當將形成的凝膠的溫度從20℃提高到60℃時,存儲模量和損耗模量之間沒有交叉。

圖2 瓊脂糖、PF127、明膠和復合水凝膠的差示掃描量熱法(DSC)熱圖

瓊脂糖、PF127、明膠和復合水凝膠的熱圖如圖2所示。PF127在57℃處出現一個與其熔化溫度對應的吸熱尖峰。熔化峰也出現在含有3%瓊脂糖的復合水凝膠的所有熱圖中,表明PF127仍處于結晶狀態。在含有5%瓊脂糖的復合水凝膠中,沒有PF127的熔化峰,表明PF127已經轉化為非定形形式,賦予系統更高的靈活性。瓊脂糖濃度依賴性的PF127結晶度的降低可能歸因于瓊脂糖對PF127的塑化,表明兩種聚合物之間可能存在分子間相互作用。含5%瓊脂糖的復合水凝膠比3%瓊脂糖水凝膠更適合打印系統。

圖3 復合水凝膠的FTIR光譜

對于PF127粉末,1342和1360 cm-1處的兩個帶對應于甲烯組的擺動(ω)振動,1241和1279 cm-1處的兩個帶對應于扭轉振動(圖3A)。在1060、1099和1146 cm-1處,C-O-C的拉伸(ν)振動可以視為三個主要條帶(圖3B)。在961處觀察到的峰值對應于甲烯組的搖擺(ρ)(圖3C)。在增加瓊脂糖濃度或明膠濃度時,甲烯和甲烯剪切(δ)振動的2881(圖3D)和1466cm-1(圖3E)的消失也證實PF127以水合而非定形的形式存在。在圖3F中可以觀察到931和771 cm-1處的3,6-無氫半乳糖彎曲帶,以及β-半乳糖單元在881 cm-1處的C-H彎曲振動,以及1037 cm-1處的C-O的拉伸振動帶。在1519 cm-1處,所有水凝膠復合材料的N-H波段強度均有所下降(圖3G),揭示明膠的N-H基團在復合水凝膠中存在相互作用。FTIR結果證實了PF127、明膠和瓊脂糖之間的相互作用。

圖4 L929細胞生長6天后的情況

本研究在水凝膠配方中加入少量的凝膠(0.25%和0.5% W/W),以提高細胞對瓊脂糖/PF127復合水凝膠的粘附性。圖4顯示在水凝膠上生長的L929成纖維細胞的顯微圖像,顯示L929細胞在含0.5%明膠配制的水凝膠上密度更密集,而在不含或只含0.25%明膠的水凝膠上生長的細胞更少。

圖5 PF127芯墨的可打印性和打印組裝好的植入物

在低進料速率下,獲得了厚度不均勻的細絲(圖5A、B)。圖5C描述了30%(w/w)PF127的擠壓細絲。此外,熒光標記的AF488siRNA-脂質體RNAiMAX復合物可以均勻地裝載在PF127核心墨水中(圖5D)。Design2由空間為0.4 mm的5層線,空間為0.8mm的3層線,空間為0.5 mm的2層線組成,排列順序如圖5E所示。Design3和Design4僅制作了6層,但它們的線間距不同,Design3的4層為0.4 mm,2層為0.7 mm,Design4的6層為0.4 mm(圖5E)。

圖6 種植體的腫脹指數

圖6顯示所有的種植體都具有較高的腫脹特性。種植體在緩沖液中的腫脹普遍高于水中。種植體Design3在緩沖液中加入30 min后腫脹指數最高。1h后,種植體Design3的腫脹指數仍顯著高于Design1,說明更寬的打印模式和更少層數的Design3促進植入物內水的快速擴散,從而快速膨脹。種植體Design4在所有時間點的腫脹指數均比Design1高,意味著水對10層植入物的侵入需要更長的時間。用H-N緩沖液提取植入體后,植入體Design1、2、3和4的質量百分圖如圖6D所示,種植體Design3在所有研究設計中質量損失率最高,其次分別是Design4、2和1。

圖7 從3D打印植入物中提取siRNA的體外釋放研究

siRNA復合物的釋放譜如圖7a所示,結果顯示,3D打印植入物可以成功地維持siRNA復合物的釋放超過30天。在Design1、2、4和3中,Design3在30天內累計釋放的siRNA%的復合物速度最快。與在凝膠中遷移的游離siRNA樣品相比,釋放的siRNA樣品的條帶在瓊脂糖凝膠中沒有遷移(圖7B),表明釋放的siRNA樣品保持復雜形式,沒有檢測到游離siRNA。

圖8 瓊脂糖環的設計和在細胞活力實驗中用于研究從植入物中釋放的siRNA復合物的作用的程序示意圖

為了研究釋放的siRNA是否仍然具有功能,再次測試CD siRNA作為一種模型癌細胞對SAOS-2細胞的影響。本研究開發了一種特殊的細胞培養裝置,其中植入物每隔一天從孔移動到孔,而植入物不直接與細胞接觸。這是通過一個支持的瓊脂糖環來實現的,允許將植入物放置在細胞的上方,因此細胞可以用釋放的siRNA復合物來處理(圖8)。SAOS-2細胞在與細胞殺傷siRNA植入物孵育后的活力被用來作為釋放復合物功能的指示指標。將細胞(3×104)接種于12個孔板中,將200μL 6%瓊脂糖溶液鑄造在孔壁上形成環,以防止細胞與植入物之間的物理接觸(圖8)。

圖9 用3D打印植入物 Design 4和Design 2處理后的SAOS-2細胞活力

實驗采用Design 4和Design 2的植入物進行。SAOS-2細胞處理后的存活率如圖9所示。在植入物Design 4中,在所有時間點,CD siRNA處理的細胞的活力都低于NC siRNA植入物處理的細胞(圖9A)。在植入物Design 2中,CD siRNA植入物處理的細胞的存活率似乎都低于NC siRNA植入物處理的細胞(圖9B)。

總之,本研究的目的是制造一個3D打印的“核殼”植入物,用于局部傳遞siRNA。在此提出了3D打印技術作為一種簡單的自動制造策略,以提供植入siRNA的治療。3D打印可以根據每個患者的需要進行定制不同的形狀和尺寸。此外,本研究提出了水凝膠復合物作為外殼材料,因為水凝膠植入物比剛性聚合物植入物更有利。用瓊脂糖、PF127和明膠制備復合水凝膠,其成分分別為5、3、0.5%。PF127在水凝膠中與瓊脂糖基質相互作用,轉化為無定形形式。由于明膠含量,水凝膠具有良好的熱響應特性,因此被用于3D打印,以制造控釋植入物,用于局部個性化siRNA治療(例如在切除的腫瘤腔內)。利用制備的復合瓊脂糖、PF127和明膠水凝膠進行3D打印,打印包含siRNA裝載的多核外殼,以賦予植入物的機械強度,并控制siRNA復合物從核心的釋放。通過改變植入物設計的打印模式,成功地控制siRNA復合物的釋放譜,從而獲得更快或持續的釋放譜。本研究中的3D打印植入物為個性化siRNA治療提供了一個很有前景的傳遞系統。總的來說,本研究提出的3D打印植入物代表一種RNA傳遞系統,可用于各種疾病的治療,或作為用于組織工程目的的細胞游離RNA負載系統。



文章來源:

https://doi.org/10.1002/adhm.202301643

(責任編輯:admin)

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