徐銘恩教授

肝臟是人體藥物代謝的主要器官，通過研究藥物在肝臟中的代謝機(jī)制，可以幫助我們篩選針對某些疾病的藥物。而通過3D生物打印技術(shù)打印出的肝組織，可以代替實(shí)驗動物或器官，應(yīng)用于我們的藥物篩選中。

肝組織單元與3D打印

肝臟是由大概50-100萬的肝小葉結(jié)構(gòu)組成的。因此，我們的設(shè)想是，如果能夠在體外把肝小葉結(jié)構(gòu)設(shè)計好打印出來，并且使它具有功能，就能夠像集成電路一樣把它們集成起來，最后變成一個肝臟。因此，我們的關(guān)注點(diǎn)是在怎樣構(gòu)建肝小葉的層次上的。

肝小葉有很多特殊的結(jié)構(gòu)，如中央靜脈、肝板、肝血竇等。除了細(xì)胞本身的表型以外，這些結(jié)構(gòu)對于最后功能的實(shí)現(xiàn)也會有影響，這也是3D打印的特長所在，因此我們通過增加表面積、增加內(nèi)部液體的湍流等，研究了這些結(jié)構(gòu)對肝臟的影響。

組織的打印與細(xì)胞的培養(yǎng)

首先我們打印了如正方形、三角形等不同結(jié)構(gòu)的組織，在這些組織中，細(xì)胞會不停地復(fù)制分裂，然后形成一個一個的微球。這個微球會進(jìn)一步發(fā)展，到第13天的時候，這些微球之間會發(fā)生連接并融合。長到30天的時候，組織內(nèi)部會形成一些典型結(jié)構(gòu)，一個就是支架完全被打印進(jìn)去的肝臟細(xì)胞所替代，除了替代掉的之外，還有一些材料沒有降解掉的，在這部分材料中也有一些細(xì)胞團(tuán)的存在。因為內(nèi)部出現(xiàn)了低氧的環(huán)境，所以組織里面自發(fā)地出現(xiàn)了非常多的類似血管的通道，保證了內(nèi)部養(yǎng)分的供應(yīng)。

通過激光共聚焦的方式，我們可以觀察內(nèi)部細(xì)胞的存活情況。從13天的數(shù)據(jù)來看，存活率是比較高的，而之后存活率也一直保持了一個比較高的狀態(tài)。

打印過程中的質(zhì)量控制

在培養(yǎng)出了具有結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的組織以后，我們在研究功能的時候發(fā)現(xiàn)，功能的標(biāo)準(zhǔn)偏差非常大。這到底是因為細(xì)胞功能、打印處理或者誘導(dǎo)的問題，還是本身結(jié)構(gòu)的問題呢?

結(jié)構(gòu)問題是我們在細(xì)胞表型后需要考慮的，因為水凝膠是非常軟的一種材料，在打印過程中，就有較大的形變。我們建立了一套復(fù)合合多種成像技術(shù)和處理算法的系統(tǒng)，對打印結(jié)構(gòu)進(jìn)行一個深度檢測和分析。在整個過程中我們發(fā)現(xiàn)，其實(shí)打印過程已經(jīng)出現(xiàn)了非常多的問題，比如材料形變以及交聯(lián)過程中控制的不準(zhǔn)確等。

在此基礎(chǔ)上，我們建立了一系列的算法，對材料的孔徑、連通率、表面積等因素做了定量化的分析。利用這些算法我們可以做一個質(zhì)控，使得打印的結(jié)構(gòu)更為精準(zhǔn)地符合我們的設(shè)計。雖然生物本來就是非線性的，但是我們發(fā)現(xiàn)，對于結(jié)構(gòu)的控制是線性相關(guān)的，這意味著我們可以對整個過程進(jìn)行精準(zhǔn)的反饋控制。相比之下，如果沒有基于這套量化分析的算法，不做控制打印出來的結(jié)構(gòu)的差異性是非常大的，而結(jié)構(gòu)的不同直接帶來了細(xì)胞生物活性的不一樣。

檢測細(xì)胞增殖

在排除掉結(jié)構(gòu)以及增殖過程對結(jié)構(gòu)的破壞因素之后，我們對細(xì)胞的增殖情況做了檢測。

細(xì)胞的增殖開始有個快速的增長過程，接著會進(jìn)入一個相對緩慢的增長過程。大概在17-22天以后，細(xì)胞增殖進(jìn)入了一個相對平臺期，此時我們可以檢測它們的一些基本因素。比如白蛋白，而白蛋白的分泌在8周的時間里一直維持在一個比較平穩(wěn)的分泌水平。當(dāng)然，P450酶系、CYP3A4基因的表達(dá)等，也都是我們關(guān)注的點(diǎn)。

從整體上來看，跟平面培養(yǎng)的數(shù)據(jù)相比，3D打印之后的細(xì)胞內(nèi)一些P450酶系基因的表達(dá)不但沒有增加，反而開始降低了，特別是到2-3天的時候達(dá)到一個低值。在排除掉打印過程中壓力和剪切力等導(dǎo)致了細(xì)胞表型發(fā)生變化等這些因素后，我們發(fā)現(xiàn)主要的原因應(yīng)該是長時間平面培養(yǎng)的這些細(xì)胞在重新回到3D的環(huán)境下，本身就有一個適應(yīng)期。

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藥物試驗

過了66個小時之后，細(xì)胞增殖的數(shù)量就開始上升，大概20天以后，我們用利福平這一典型的用來做肝損的陽性藥物的實(shí)驗。

我們設(shè)置了平面對照，發(fā)現(xiàn)差異非常大，不管這種差異是不是更接近于人體真實(shí)情況，差異的存在本身就意味著平面和3D之間存在區(qū)別，說明這個研究是有價值的。

比如說我們這里利福平它明顯地呈現(xiàn)對肝功能更為長時間的影響。首先是三維條件下CYP3A4的表達(dá)相比平面的表達(dá)時間更長。第二在利福平的作用下會有一些長期的毒性顯示出來。

圍繞利福平，我們又做了一系列的數(shù)據(jù)，包括從CYP2B6，MRP2，BSEP等一系列跟肝臟藥物代謝相關(guān)的基因表達(dá)，跟平面之間都存在顯著差異。還有苯巴比妥、奧美拉唑等幾個典型的陽性藥物，在這樣的模型中相比傳統(tǒng)的平面是有區(qū)別的。

在這個基礎(chǔ)上，我們嘗試開發(fā)高通量篩選技術(shù)。高通量篩選需要基于在線即時檢測的技術(shù)。我們建立了包含多個叉指電極陣列的芯片，它依靠的是細(xì)胞跟電極之間接觸的阻抗來在線檢測細(xì)胞的增殖、遷移和死亡情況。

打印之后有幾個問題要解決。這種電極的設(shè)計是針對培養(yǎng)在平面的細(xì)胞，而現(xiàn)在細(xì)胞跟材料混在一起，我們需要確認(rèn)在這種情況下能否測到它的增殖和死亡情況。

我們做了一系列的測試，包括加不同的溶液，檢測頻率等條件，看它對細(xì)胞的信號的檢測有沒有影響。我們用傳統(tǒng)的Alamar bule實(shí)驗和細(xì)胞芯片的方式檢測過組織的增殖過程，在線性上是基本一致的。

腫瘤藥物篩選所希望的結(jié)果是，篩選出的藥物能夠最大程度殺死腫瘤細(xì)胞同時對正常細(xì)胞的損傷最小。我們把肝臟組織和和腫瘤組織打印在一塊芯片上，從陽性藥物檢測來看，這個模型可以進(jìn)行精準(zhǔn)篩選。

同時我們也發(fā)現(xiàn)，一些需要肝臟二次代謝物才有很強(qiáng)的抗腫瘤毒性的藥物，在這個模型中也能被篩選出來。

我們今后想做的一些工作是，比如通過集成將多種組織在一塊芯片上，然后加上肝臟看他們之間的反應(yīng)。

最后做一個總結(jié)，首先我覺得3D打印這個技術(shù)在個性化需求強(qiáng)烈的生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有很大的應(yīng)用價值，對于科學(xué)研究來說它是一個很好的工具。特別是這個工具可以有可控結(jié)構(gòu)的材料以及可以把細(xì)胞打印成特殊的結(jié)構(gòu)。無論為組織工程也好，藥物的精準(zhǔn)化篩選、個性化給藥也好，都是提供了一種全新的可能。

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