基于人誘導多能干細胞來源心肌細胞的功能性心肌組織直接3D打印構(gòu)建
時間：2023-11-02 09:33 來源：生物打印與再生工程 作者：admin 閱讀：次
生物制造的一個目標是通過設計組織、器官或它們的一部分來研究或治療治療方法有限的疾病，如終末期器官衰竭。但是當前傳統(tǒng)生物制造方法具有細胞難定殖，不能生成有層次的結(jié)構(gòu)等局限性。鑒于目前生物制造的局限性，特別是在心臟組織工程領域，需要開發(fā)一種方法，利用生物3D打印將人體誘導多功能干細胞衍生的心肌細胞（hiPSC-CMs）直接打印到功能性心臟組織中。然而，直接打印活細胞已被證明是困難的。
來自德國埃爾朗根大學的T.U. Esser團隊于2023年9月在ADVANCED MATERIALS發(fā)表了一篇名為《Direct 3D-Bioprinting of hiPSC-derived Cardiomyocytes to Generate Functional Cardiac Tissues》的文章，文中提出了一種直接3D生物打印人類誘導多能干細胞(hiPSC)來源的心肌細胞的方法——在膠原透明質(zhì)酸墨水中，以準確和可重復的方式打印厘米大小的功能性環(huán)形和心室形狀的心臟組織。打印的組織含有hiPSC衍生的心肌細胞，具有組織良好的肌體，并表現(xiàn)出自發(fā)和規(guī)律的，持久的收縮，而且能夠抵抗被動受力。打印心臟組織的跳動頻率可以通過藥物刺激來調(diào)節(jié)。這種方法為產(chǎn)生復雜的功能心臟組織提供了新的可能性：可以用于制造高級藥物篩選的模型，也可以用于器官修復或替換的組織移植。
實驗結(jié)果與討論
一、懸浮支撐浴的制備
凝膠內(nèi)懸浮打印需要一個支撐浴。支撐浴一方面提供足夠的穩(wěn)定性來保持打印液體墨水的形狀，另一方面能夠使打印噴嘴通過。為了將hiPSC衍生的心肌細胞(hiPSC-CMs)打印成復雜的形狀，該團隊開發(fā)了一種簡單的三步雙組分方案，通過復雜凝聚生產(chǎn)明膠/阿拉伯膠微粒。微顆粒以圓形為主，(直徑69±27 μm，圖1b,c)。通過離心壓實后，微粒形成了具有自愈特性的支撐浴，允許打印噴嘴自由通過。即使容器被倒置，打印到支撐浴中的食用染料也能保持在原位(圖1d)。
在測試頻率范圍內(nèi)，支撐浴顯示出固體狀行為以及剪切稀化行為(圖1f)。此外，在交替剪切速率下，支撐浴表現(xiàn)出近乎瞬時和完全的恢復行為(圖1g)。
二、膠原蛋白/透明質(zhì)酸生物墨水能夠精確和重現(xiàn)復雜結(jié)構(gòu)的打印
為了評估膠原蛋白在上述支撐浴中的可打印性，該團隊用不同濃度的膠原墨水打印脫細胞環(huán)狀結(jié)構(gòu)(圖2a)。此外，透明質(zhì)酸(HA)（一種糖胺聚糖），被添加到膠原蛋白中，以改善生物墨水的可打印性。為了評估印刷環(huán)的均勻性和印刷過程的再現(xiàn)性，用多個印刷環(huán)的圖像生成重疊圖(圖2a)。
隨著膠原蛋白含量的增加，重疊圖顯示出更均勻的印刷環(huán)，邊界更光滑，其中用4.0mg/ml膠原蛋白原液制成的油墨可重復性更好(圖2a)。HA明顯改善了≥2.0 mg/ml膠原打印環(huán)的均勻性 (圖2b)。隨著膠原和透明質(zhì)酸濃度的增加，強度譜顯示出更小的差異。該團隊最終選擇了由3.0 mg/ml膠原- i和3.0 mg/ml HA (CollHA3-3)組成的生物鏈進行進一步的研究，因為其在實際測試中，提供了最高的再現(xiàn)性以及對擠出速度的最佳控制，且打印出的環(huán)的壁厚較薄。
為了檢驗打印過程的準確性，該團隊打印了不同的幾何形狀(環(huán)形、網(wǎng)格和星形)。打印結(jié)構(gòu)具有明確的尖銳邊緣，可以準確地再現(xiàn)底層3D模型(圖2c)。交替使用對比劑和不使用對比劑(同心圓或堆疊矩形)打印CollHA3-3，可以得到連續(xù)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，表明兩種油墨在跨層融合(圖2d)。
來自德國埃爾朗根大學的T.U. Esser團隊于2023年9月在ADVANCED MATERIALS發(fā)表了一篇名為《Direct 3D-Bioprinting of hiPSC-derived Cardiomyocytes to Generate Functional Cardiac Tissues》的文章，文中提出了一種直接3D生物打印人類誘導多能干細胞(hiPSC)來源的心肌細胞的方法——在膠原透明質(zhì)酸墨水中，以準確和可重復的方式打印厘米大小的功能性環(huán)形和心室形狀的心臟組織。打印的組織含有hiPSC衍生的心肌細胞，具有組織良好的肌體，并表現(xiàn)出自發(fā)和規(guī)律的，持久的收縮，而且能夠抵抗被動受力。打印心臟組織的跳動頻率可以通過藥物刺激來調(diào)節(jié)。這種方法為產(chǎn)生復雜的功能心臟組織提供了新的可能性：可以用于制造高級藥物篩選的模型，也可以用于器官修復或替換的組織移植。
實驗結(jié)果與討論
一、懸浮支撐浴的制備
凝膠內(nèi)懸浮打印需要一個支撐浴。支撐浴一方面提供足夠的穩(wěn)定性來保持打印液體墨水的形狀，另一方面能夠使打印噴嘴通過。為了將hiPSC衍生的心肌細胞(hiPSC-CMs)打印成復雜的形狀，該團隊開發(fā)了一種簡單的三步雙組分方案，通過復雜凝聚生產(chǎn)明膠/阿拉伯膠微粒。微顆粒以圓形為主，(直徑69±27 μm，圖1b,c)。通過離心壓實后，微粒形成了具有自愈特性的支撐浴，允許打印噴嘴自由通過。即使容器被倒置，打印到支撐浴中的食用染料也能保持在原位(圖1d)。
在測試頻率范圍內(nèi)，支撐浴顯示出固體狀行為以及剪切稀化行為(圖1f)。此外，在交替剪切速率下，支撐浴表現(xiàn)出近乎瞬時和完全的恢復行為(圖1g)。
圖1 壓實后的微顆粒表現(xiàn)出剪切變薄和自愈的特性
二、膠原蛋白/透明質(zhì)酸生物墨水能夠精確和重現(xiàn)復雜結(jié)構(gòu)的打印
為了評估膠原蛋白在上述支撐浴中的可打印性，該團隊用不同濃度的膠原墨水打印脫細胞環(huán)狀結(jié)構(gòu)(圖2a)。此外，透明質(zhì)酸(HA)（一種糖胺聚糖），被添加到膠原蛋白中，以改善生物墨水的可打印性。為了評估印刷環(huán)的均勻性和印刷過程的再現(xiàn)性，用多個印刷環(huán)的圖像生成重疊圖(圖2a)。
隨著膠原蛋白含量的增加，重疊圖顯示出更均勻的印刷環(huán)，邊界更光滑，其中用4.0mg/ml膠原蛋白原液制成的油墨可重復性更好(圖2a)。HA明顯改善了≥2.0 mg/ml膠原打印環(huán)的均勻性 (圖2b)。隨著膠原和透明質(zhì)酸濃度的增加，強度譜顯示出更小的差異。該團隊最終選擇了由3.0 mg/ml膠原- i和3.0 mg/ml HA (CollHA3-3)組成的生物鏈進行進一步的研究，因為其在實際測試中，提供了最高的再現(xiàn)性以及對擠出速度的最佳控制，且打印出的環(huán)的壁厚較薄。
為了檢驗打印過程的準確性，該團隊打印了不同的幾何形狀(環(huán)形、網(wǎng)格和星形)。打印結(jié)構(gòu)具有明確的尖銳邊緣，可以準確地再現(xiàn)底層3D模型(圖2c)。交替使用對比劑和不使用對比劑(同心圓或堆疊矩形)打印CollHA3-3，可以得到連續(xù)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，表明兩種油墨在跨層融合(圖2d)。
圖2 膠原蛋白/透明質(zhì)酸油墨使打印結(jié)構(gòu)穩(wěn)定
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