基于人誘導多能干細胞來源心肌細胞的功能性心肌組織直接3D打印構建(2)
時間：2023-11-02 09:33 來源：生物打印與再生工程 作者：admin 閱讀：次
三、環(huán)形功能性心臟組織的可重復和準確的3D生物打印
為了生產有層次結構的組織或器官，控制細胞分布是很重要的。因此，在印刷前需要將細胞摻入油墨中。為了評估細胞的添加是否會影響墨水的可打印性，該團隊將25 Mio/ml hiPSC-CMs加入到CollHA3-3墨水中，用以打印環(huán)狀組織。所得到的環(huán)是穩(wěn)定的，并表現(xiàn)出良好的均勻性 (圖3a)。
在組織構建后(第0天)和制造后7天（第7天)使用鈣黃素- am /乙錠同二聚體-1（EthD-1)對打印的組織和通過滴鑄生產的組織進行染色。在任何時間點，鑄型組織和打印組織的活力均無顯著差異。在第30天通過免疫熒光染色觀察hiPSC-CMs的切片和整個組織的形態(tài)和分布。打印的hiPSC-CMs顯示出典型的肌合成α-肌動蛋白條紋，以及緩慢的骨骼肌鈣蛋白- i (ssTnI)和心臟肌鈣蛋白- i (cTnI)(圖3b)。打印組織中α-肌動蛋白的表達均勻分布(圖3c)。同時，ssTnI的表達水平向組織邊緣升高，證明了打印的hiPSC-CMs的行為與分化和鑄造的hiPSC-CMs相似，表明了打印的hiPSC-CMs生成了有組織的肌瘤，并且具有相互連接的不同成熟狀態(tài)的hiPSC-CMs。
45個打印組織中在第3天已經表現(xiàn)出了自發(fā)的同心收縮(圖3D)。通過Fluo-4熒光強度的增強和減弱反映了打印組織在收縮周期中表現(xiàn)出鈣的同步流入和流出 (圖3f)。測量不同區(qū)域的熒光強度可以識別出起搏中心(ROI3，圖3g)，其行為隨著時間的推移顯示出高同步性，遠處區(qū)域達到熒光強度峰值的延遲約為100 ms(1幀)(圖3g)。這進一步證明了hiPSC-CMs在打印組織內形成了相互連接的網絡。
為了適用于作為模型系統(tǒng)或移植，工程心臟組織必須對藥物刺激表現(xiàn)出生理反應。因此，對打印組織首先用腎上腺素能激動劑苯腎上腺素(PE)處理，然后用維拉帕米(Ver)處理（一種l型鈣通道抑制劑）。PE刺激導致收縮頻率翻倍，但收縮程度并無顯著變化(圖3i,j)。隨后加入維拉帕米，收縮停止(圖3i,j)。
圖3 打印hiPSC衍生的心肌細胞形成功能性心臟組織
四、打印的心臟組織對被動阻力施加同心力
為了檢驗打印的環(huán)是否可以施加類似于心臟的同心圓力，該團隊設計并制造了由六個柔性柱組成的陣列(圖4a)。將打印的環(huán)轉移到柱陣列上，并在柱子周圍壓實，培養(yǎng)至第30天(圖4b)。在收縮周期中，打印的環(huán)能夠同步使6根柱子發(fā)生偏轉，說明它們能夠對阻力施加同心圓力。
與自由漂浮的環(huán)一樣，這些環(huán)在第3天出現(xiàn)了自發(fā)收縮。到第28天，收縮頻率在每分鐘20次左右保持穩(wěn)定，第30天略有下降(圖4c)。在第30天進行PE和Ver處理。PE刺激顯著增加了被動機械刺激環(huán)的收縮頻率 (圖4f)。根據(jù)柱撓度計算打印組織的產生的力，PE刺激后產生的力增加(圖4g)。Ver處理顯著降低了收縮頻率和產生的力，24個環(huán)中有22個停止了跳動(圖4f、g)。這里打印的環(huán)所產生的力與僅由人類多能干細胞衍生的心肌細胞產生的力相似。
圖4 打印的心臟組織對被動阻力施加同心力
五、膠原蛋白/透明質酸墨水3D生物打印人類心臟心室功能模型
為了測試該方法是否能夠實現(xiàn)人類心臟心室功能模型的3D生物打印，團隊設計并打印了一個高度為14毫米，最寬處直徑為8毫米的模型(圖5a)。
心室在制造后7天達到穩(wěn)定，并發(fā)生自發(fā)的同步收縮，在培養(yǎng)過程中持續(xù)長達100天(圖5b,c)。此外，PE刺激可使培養(yǎng)30 天的打印心室模型收縮頻率加快 (圖5d)。對染色心室的分析顯示，hiPSC-CMs在第100天顯現(xiàn)出典型的α-肌動蛋白和cTnI的條紋(圖5e)。hiPSC-CMs分布在整個打印組織中，α-肌動蛋白和cTnI表現(xiàn)出相似的表達模式(圖5f)。實驗表明：該組織至少可以培養(yǎng)100天。
圖5 凝膠方法使功能心室模型的3D生物打印成為可能
總結
本文展示了直接打印嵌入膠原基生物墨水的hiPSC-CMs生成功能性心臟組織的方法。以下結果可有力支持這一結論：hiPSC-CMs可以精確且可重復地3D生物打印成多種形狀的心臟組織，并形成相互連接的、自發(fā)和同步收縮網絡，并且可以通過藥物刺激來調節(jié)頻率；打印組織能夠對抗被動阻力發(fā)生收縮。這里開發(fā)的方法為生成復雜的功能性心臟組織開辟了新的可能性：直接打印hiPSC-CMs以及打印其他細胞類型的方法，可用于打印健康和患病的心臟模型。此外，精確放置不同心肌細胞亞型的能力，加上在生物墨水中添加導電材料的技術，在未來可以進一步模擬整個組織中的動作電位傳播，以更準確地復制心臟電生理。
參考文獻
Tilman U. Esser, Annalise Anspach, Katrin A. Muenzebrock, Delf Kah, Stefan Schrüfer, Joachim Schenk, Katrin G. Heinze, Dirk W. Schubert, Ben Fabry, Felix B. Engel*(2023). Direct 3D-bioprinting of hiPSC-derived cardiomyocytes to generate functional cardiac tissues
https://doi.org/10.1002/adma.202305911
(責任編輯：admin)
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