《Science Advances》：3D打印生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠助力肌腱再生
時(shí)間：2024-05-16 08:54 來源：EngineeringForLife 作者：admin 閱讀：次
肌腱連接處（MTJ）是位于肌肉和肌腱交界處的一種復(fù)雜而特殊的組織，負(fù)責(zé)將力量從收縮的骨骼肌通過肌腱傳遞到骨骼。作為肌肉和肌腱的交界處，MTJ
在日常運(yùn)動(dòng)或鍛煉中的重復(fù)負(fù)荷下承受著集中的機(jī)械應(yīng)力，因此，MTJ 的損傷非常普遍。據(jù)報(bào)道，28% 的肌肉-肌腱-骨骼復(fù)合體損傷發(fā)生在
MTJ，其風(fēng)險(xiǎn)在肌肉、肌腱、肌肉-肌腱界面和肌腱-骨骼界面損傷中位居第二。目前臨床上治療 MTJ
損傷的方法包括非甾體抗炎藥和物理療法等保守療法，以及使用各種縫合技術(shù)進(jìn)行手術(shù)干預(yù)。然而，其有效性受到以下幾個(gè)方面的限制：(i)瘢痕組織的形成導(dǎo)致機(jī)械強(qiáng)度不足，導(dǎo)致治療后復(fù)發(fā)率較高；(ii)MTJ
損傷處或附近的縫合切口，經(jīng)常導(dǎo)致 MTJ 重建失敗；(iii)大面積 MTJ
缺損的修復(fù)具有挑戰(zhàn)性，尤其是在肌肉和肌腱損傷后回縮的情況下。因此，目前的干預(yù)措施無法同時(shí)促進(jìn) MTJ
的結(jié)構(gòu)和功能修復(fù)，因此有必要開發(fā)前景廣闊的高質(zhì)量 MTJ 再生策略。
來自南京醫(yī)科大學(xué)的姚慶強(qiáng)團(tuán)隊(duì)與來自東南大學(xué)的張薇等團(tuán)隊(duì)合作開發(fā)了一種含有間充質(zhì)干細(xì)胞和 Klotho 的3D打印生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠，用于 MTJ 的結(jié)構(gòu)和功能再生。在大鼠MTJ缺損模型中，生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠促進(jìn)了肌肉、肌腱和肌肉-肌腱界面的結(jié)構(gòu)恢復(fù)，并增強(qiáng)了損傷MTJ的功能恢復(fù)。體內(nèi)蛋白質(zhì)組學(xué)和體外細(xì)胞培養(yǎng)闡明了生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的再生機(jī)制，從而設(shè)計(jì)出一種優(yōu)化的微環(huán)境來支持移植間充質(zhì)干細(xì)胞的存活和分化，并維持 MTJ 組織內(nèi)常駐細(xì)胞（包括肌腱/肌肉細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）的功能表型。這種策略為治療 MTJ 損傷提供了一種前景廣闊的方法。相關(guān)工作以題為“Bioactive fiber-reinforced hydrogel to tailor cell microenvironment for structural and functional regeneration of myotendinous junction”的文章發(fā)表在2024年04月24日的國(guó)際頂級(jí)期刊《Science Advances》。
1. 創(chuàng)新型研究?jī)?nèi)容
本研究開發(fā)了一種3D打印纖維增強(qiáng)多功能水凝膠，為MTJ的結(jié)構(gòu)和功能再生提供足夠的機(jī)械支持和定制合適的微環(huán)境（圖1A）。在這種生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠系統(tǒng)中，3D打印聚（乳酸-共聚-乙醇）酸（PLGA）支架具有良好的排列結(jié)構(gòu)，可為MTJ的生理功能提供足夠的機(jī)械強(qiáng)度；間充質(zhì)干細(xì)胞的引入可增強(qiáng)肌肉和肌腱的促再生生物活性，Klotho的負(fù)載可改善MTJ損傷后外源性間充質(zhì)干細(xì)胞和內(nèi)源性MTJ駐留細(xì)胞的病理環(huán)境；此外，將光交聯(lián)甲基丙烯酰絲纖維素（SilMA）水凝膠融合到 PLGA 支架中，作為輸送 Klotho 的載體，并為間充質(zhì)干細(xì)胞的保留和存活提供3D富水微環(huán)境。本研究首先評(píng)估了生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠的理化性質(zhì)和細(xì)胞相容性。隨后，將水凝膠系統(tǒng)植入大鼠 MTJ 缺陷模型，以評(píng)估其在促進(jìn) MTJ 結(jié)構(gòu)和功能再生方面的原位功效。進(jìn)行了體內(nèi)蛋白質(zhì)組學(xué)分析，以揭示水凝膠系統(tǒng)促進(jìn) MTJ 再生的內(nèi)在機(jī)制。根據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果，進(jìn)行了進(jìn)一步研究，探討通過水凝膠系統(tǒng)操縱細(xì)胞微環(huán)境是否以及如何調(diào)節(jié)移植間充質(zhì)干細(xì)胞和常駐細(xì)胞的行為，從而促進(jìn) MTJ 再生。
【制備生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠并對(duì)其進(jìn)行表征】
為MTJ再生設(shè)計(jì)一種具有足夠機(jī)械強(qiáng)度和再生生物活性的理想組織工程支架，本研究開發(fā)了一種負(fù)載間充質(zhì)干細(xì)胞和 Klotho 的 PLGA 纖維增強(qiáng) SilMA 水凝膠（圖 1A）。利用熔融沉積建模（FDM）3D打印技術(shù)，制作了具有正交排列網(wǎng)格和相互連接的大孔的 PLGA 支架，為受傷的 MTJ 的力傳導(dǎo)和組織生長(zhǎng)提供機(jī)械和結(jié)構(gòu)支持。隨后，將 SilMA 前體、間充質(zhì)干細(xì)胞和重組 Klotho 的混合物融合到 PLGA 支架中，并通過光交聯(lián)形成具有微孔和互連結(jié)構(gòu)的纖維增強(qiáng)水凝膠。作為間充質(zhì)干細(xì)胞和生物活性分子的多功能載體，SilMA 水凝膠的引入提高了間充質(zhì)干細(xì)胞的保留率，為細(xì)胞生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)交換建立了有利的3D微環(huán)境，并有效地充當(dāng)了 Klotho 的釋放系統(tǒng)。掃描電子顯微鏡（SEM）圖像顯示，微孔 SilMA 水凝膠滲入大孔 PLGA 支架的間隙中，從而提供了有利于細(xì)胞粘附的更佳微環(huán)境（圖 1B）。PLGA（PA）、SilMA-PLGA（SM-PA）和 Klotho@SilMA-PLGA （K@SM-PA）支架的 PLGA 纖維直徑約為 340 μm（圖 1C）。此外，SM-PA 和 K@SM-PA 支架的孔面積沒有明顯差異，表明 Klotho 的加入對(duì) SilMA 水凝膠的微孔結(jié)構(gòu)沒有顯著影響（圖 1D）。對(duì)播種了間充質(zhì)干細(xì)胞的纖維增強(qiáng)水凝膠進(jìn)行的掃描電鏡分析表明，間充質(zhì)干細(xì)胞以球形或紡錘形形態(tài)包埋在 SilMA 水凝膠基質(zhì)中。
【生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠能有效促進(jìn)大鼠 MTJ 的結(jié)構(gòu)和功能再生】
利用大鼠 MTJ 缺損模型評(píng)估了本研究的生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠對(duì) MTJ 再生的功效（圖 2A）。未經(jīng)處理的 MTJ 缺損設(shè)為對(duì)照組。植入 4 周后，對(duì) MTJ 缺損處的再生組織進(jìn)行組織學(xué)檢查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，術(shù)后 4 周時(shí)，殘留支架占據(jù)了再生組織的一定空間，阻礙了典型 MTJ 結(jié)構(gòu)的清晰呈現(xiàn)。因此，位于缺損處和鄰近支架的修復(fù)組織被用來評(píng)估 MTJ 修復(fù)情況。血紅素和伊紅（H&E）以及馬森三色染色顯示，M@SM-PA 組和 K/M@SM-PA 組再生的 MTJ 組織顯示出肌肉和肌腱纖維的廣泛插入，并有明顯的相互交錯(cuò)，而 Ctrl 組和 SM-PA 組的組織則顯示出罕見、不規(guī)則和短的相互交錯(cuò)（圖 2B 和 C）。還觀察到 M@SM-PA 和 K/M@SM-PA 水凝膠比 Ctrl 和 SM-PA 支架能誘導(dǎo)形成更有組織的肌腱纖維，K/M@SM-PA 組的肌腱膠原纖維呈原生波浪狀（圖2B 和 C）。定量分析顯示，與其他三組相比，K/M@SM-PA 組的肌腱組織學(xué)評(píng)分明顯較低，表明其形成的組織更像肌腱（圖 2G）。在再生肌肉組織方面，K/M@SM-PA 組與 Ctrl、SM-PA 和 M@SM-PA 組相比，肌纖維直徑明顯增加，表明 K/M@SM-PA 水凝膠促進(jìn)了肌肉再生（圖 2B、C 和 H）。總之，這些發(fā)現(xiàn)意味著生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠在促進(jìn) MTJ 組織形成和重塑方面具有很高的功效。
本研究通過步態(tài)分析和機(jī)械測(cè)試進(jìn)一步評(píng)估了修復(fù)后 MTJ 的功能恢復(fù)情況。步態(tài)分析是通過評(píng)估行為表型來評(píng)估 MTJ 功能的一種可行且無創(chuàng)的方法。如圖 3A 至 C所示，使用實(shí)時(shí)熒光成像系統(tǒng)捕捉大鼠行走時(shí)的爪印。在指定時(shí)間點(diǎn)（術(shù)后 1 周、2 周和 4 周）收集大鼠爪印并對(duì)步態(tài)參數(shù)進(jìn)行綜合分析，包括時(shí)空參數(shù)（步長(zhǎng)、擺動(dòng)時(shí)間和擺動(dòng)速度）和強(qiáng)度參數(shù)（平均強(qiáng)度、最大接觸平均強(qiáng)度和最大接觸最大強(qiáng)度）（圖 3D 和 E）。隨著疼痛程度的增加，大鼠的行走運(yùn)動(dòng)受到不利影響，導(dǎo)致除擺動(dòng)時(shí)間外的所有上述參數(shù)下降。結(jié)果顯示，與正常大鼠相比，術(shù)后 1 周所有組大鼠的步態(tài)均出現(xiàn)異常，步長(zhǎng)和步幅明顯減少（圖 3F 和 I 至 K）。從第 1 周到第 4 周，這些參數(shù)逐漸接近甚至超過正常大鼠，其中 K/M@SM-PA 組的恢復(fù)最為明顯（圖 3F 至 K）。具體來說，術(shù)后第 2 周，K/M@SM-PA 組的步長(zhǎng)和擺動(dòng)速度值明顯高于 Ctrl 組（P < 0.05）（圖 3F 和 H）。此外，K/M@SM-PA 組大鼠的擺動(dòng)速度值在術(shù)后 2 周已超過正常大鼠（圖 3H）。在擺動(dòng)時(shí)間方面，K/M@SM-PA組大鼠在術(shù)后1周和2周的擺動(dòng)時(shí)間值最低，表明K/M@SM-PA水凝膠治療后大鼠的行走運(yùn)動(dòng)得到了改善，但組間差異不顯著（圖3G）。此外，K/M@SM-PA 組的強(qiáng)度參數(shù)在所有組別中表現(xiàn)出最高水平，包括術(shù)后 4 周的平均強(qiáng)度、最大接觸平均強(qiáng)度和最大接觸最大強(qiáng)度（圖 3I 至 K）。這表明，K/M@SM-PA 治療后，大鼠的站立姿勢(shì)更加穩(wěn)定，疼痛減輕。總之，上述步態(tài)分析表明，在植入生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠后，MTJ 的功能恢復(fù)得到了顯著改善。
來自南京醫(yī)科大學(xué)的姚慶強(qiáng)團(tuán)隊(duì)與來自東南大學(xué)的張薇等團(tuán)隊(duì)合作開發(fā)了一種含有間充質(zhì)干細(xì)胞和 Klotho 的3D打印生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠，用于 MTJ 的結(jié)構(gòu)和功能再生。在大鼠MTJ缺損模型中，生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠促進(jìn)了肌肉、肌腱和肌肉-肌腱界面的結(jié)構(gòu)恢復(fù)，并增強(qiáng)了損傷MTJ的功能恢復(fù)。體內(nèi)蛋白質(zhì)組學(xué)和體外細(xì)胞培養(yǎng)闡明了生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的再生機(jī)制，從而設(shè)計(jì)出一種優(yōu)化的微環(huán)境來支持移植間充質(zhì)干細(xì)胞的存活和分化，并維持 MTJ 組織內(nèi)常駐細(xì)胞（包括肌腱/肌肉細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）的功能表型。這種策略為治療 MTJ 損傷提供了一種前景廣闊的方法。相關(guān)工作以題為“Bioactive fiber-reinforced hydrogel to tailor cell microenvironment for structural and functional regeneration of myotendinous junction”的文章發(fā)表在2024年04月24日的國(guó)際頂級(jí)期刊《Science Advances》。
本研究開發(fā)了一種3D打印纖維增強(qiáng)多功能水凝膠，為MTJ的結(jié)構(gòu)和功能再生提供足夠的機(jī)械支持和定制合適的微環(huán)境（圖1A）。在這種生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠系統(tǒng)中，3D打印聚（乳酸-共聚-乙醇）酸（PLGA）支架具有良好的排列結(jié)構(gòu)，可為MTJ的生理功能提供足夠的機(jī)械強(qiáng)度；間充質(zhì)干細(xì)胞的引入可增強(qiáng)肌肉和肌腱的促再生生物活性，Klotho的負(fù)載可改善MTJ損傷后外源性間充質(zhì)干細(xì)胞和內(nèi)源性MTJ駐留細(xì)胞的病理環(huán)境；此外，將光交聯(lián)甲基丙烯酰絲纖維素（SilMA）水凝膠融合到 PLGA 支架中，作為輸送 Klotho 的載體，并為間充質(zhì)干細(xì)胞的保留和存活提供3D富水微環(huán)境。本研究首先評(píng)估了生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠的理化性質(zhì)和細(xì)胞相容性。隨后，將水凝膠系統(tǒng)植入大鼠 MTJ 缺陷模型，以評(píng)估其在促進(jìn) MTJ 結(jié)構(gòu)和功能再生方面的原位功效。進(jìn)行了體內(nèi)蛋白質(zhì)組學(xué)分析，以揭示水凝膠系統(tǒng)促進(jìn) MTJ 再生的內(nèi)在機(jī)制。根據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果，進(jìn)行了進(jìn)一步研究，探討通過水凝膠系統(tǒng)操縱細(xì)胞微環(huán)境是否以及如何調(diào)節(jié)移植間充質(zhì)干細(xì)胞和常駐細(xì)胞的行為，從而促進(jìn) MTJ 再生。
【制備生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠并對(duì)其進(jìn)行表征】
為MTJ再生設(shè)計(jì)一種具有足夠機(jī)械強(qiáng)度和再生生物活性的理想組織工程支架，本研究開發(fā)了一種負(fù)載間充質(zhì)干細(xì)胞和 Klotho 的 PLGA 纖維增強(qiáng) SilMA 水凝膠（圖 1A）。利用熔融沉積建模（FDM）3D打印技術(shù)，制作了具有正交排列網(wǎng)格和相互連接的大孔的 PLGA 支架，為受傷的 MTJ 的力傳導(dǎo)和組織生長(zhǎng)提供機(jī)械和結(jié)構(gòu)支持。隨后，將 SilMA 前體、間充質(zhì)干細(xì)胞和重組 Klotho 的混合物融合到 PLGA 支架中，并通過光交聯(lián)形成具有微孔和互連結(jié)構(gòu)的纖維增強(qiáng)水凝膠。作為間充質(zhì)干細(xì)胞和生物活性分子的多功能載體，SilMA 水凝膠的引入提高了間充質(zhì)干細(xì)胞的保留率，為細(xì)胞生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)交換建立了有利的3D微環(huán)境，并有效地充當(dāng)了 Klotho 的釋放系統(tǒng)。掃描電子顯微鏡（SEM）圖像顯示，微孔 SilMA 水凝膠滲入大孔 PLGA 支架的間隙中，從而提供了有利于細(xì)胞粘附的更佳微環(huán)境（圖 1B）。PLGA（PA）、SilMA-PLGA（SM-PA）和 Klotho@SilMA-PLGA （K@SM-PA）支架的 PLGA 纖維直徑約為 340 μm（圖 1C）。此外，SM-PA 和 K@SM-PA 支架的孔面積沒有明顯差異，表明 Klotho 的加入對(duì) SilMA 水凝膠的微孔結(jié)構(gòu)沒有顯著影響（圖 1D）。對(duì)播種了間充質(zhì)干細(xì)胞的纖維增強(qiáng)水凝膠進(jìn)行的掃描電鏡分析表明，間充質(zhì)干細(xì)胞以球形或紡錘形形態(tài)包埋在 SilMA 水凝膠基質(zhì)中。
圖1 生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠的制造與表征
【生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠能有效促進(jìn)大鼠 MTJ 的結(jié)構(gòu)和功能再生】
利用大鼠 MTJ 缺損模型評(píng)估了本研究的生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠對(duì) MTJ 再生的功效（圖 2A）。未經(jīng)處理的 MTJ 缺損設(shè)為對(duì)照組。植入 4 周后，對(duì) MTJ 缺損處的再生組織進(jìn)行組織學(xué)檢查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，術(shù)后 4 周時(shí)，殘留支架占據(jù)了再生組織的一定空間，阻礙了典型 MTJ 結(jié)構(gòu)的清晰呈現(xiàn)。因此，位于缺損處和鄰近支架的修復(fù)組織被用來評(píng)估 MTJ 修復(fù)情況。血紅素和伊紅（H&E）以及馬森三色染色顯示，M@SM-PA 組和 K/M@SM-PA 組再生的 MTJ 組織顯示出肌肉和肌腱纖維的廣泛插入，并有明顯的相互交錯(cuò)，而 Ctrl 組和 SM-PA 組的組織則顯示出罕見、不規(guī)則和短的相互交錯(cuò)（圖 2B 和 C）。還觀察到 M@SM-PA 和 K/M@SM-PA 水凝膠比 Ctrl 和 SM-PA 支架能誘導(dǎo)形成更有組織的肌腱纖維，K/M@SM-PA 組的肌腱膠原纖維呈原生波浪狀（圖2B 和 C）。定量分析顯示，與其他三組相比，K/M@SM-PA 組的肌腱組織學(xué)評(píng)分明顯較低，表明其形成的組織更像肌腱（圖 2G）。在再生肌肉組織方面，K/M@SM-PA 組與 Ctrl、SM-PA 和 M@SM-PA 組相比，肌纖維直徑明顯增加，表明 K/M@SM-PA 水凝膠促進(jìn)了肌肉再生（圖 2B、C 和 H）。總之，這些發(fā)現(xiàn)意味著生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠在促進(jìn) MTJ 組織形成和重塑方面具有很高的功效。
圖2 生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠可促進(jìn)大鼠 MTJ 的結(jié)構(gòu)再生
本研究通過步態(tài)分析和機(jī)械測(cè)試進(jìn)一步評(píng)估了修復(fù)后 MTJ 的功能恢復(fù)情況。步態(tài)分析是通過評(píng)估行為表型來評(píng)估 MTJ 功能的一種可行且無創(chuàng)的方法。如圖 3A 至 C所示，使用實(shí)時(shí)熒光成像系統(tǒng)捕捉大鼠行走時(shí)的爪印。在指定時(shí)間點(diǎn)（術(shù)后 1 周、2 周和 4 周）收集大鼠爪印并對(duì)步態(tài)參數(shù)進(jìn)行綜合分析，包括時(shí)空參數(shù)（步長(zhǎng)、擺動(dòng)時(shí)間和擺動(dòng)速度）和強(qiáng)度參數(shù)（平均強(qiáng)度、最大接觸平均強(qiáng)度和最大接觸最大強(qiáng)度）（圖 3D 和 E）。隨著疼痛程度的增加，大鼠的行走運(yùn)動(dòng)受到不利影響，導(dǎo)致除擺動(dòng)時(shí)間外的所有上述參數(shù)下降。結(jié)果顯示，與正常大鼠相比，術(shù)后 1 周所有組大鼠的步態(tài)均出現(xiàn)異常，步長(zhǎng)和步幅明顯減少（圖 3F 和 I 至 K）。從第 1 周到第 4 周，這些參數(shù)逐漸接近甚至超過正常大鼠，其中 K/M@SM-PA 組的恢復(fù)最為明顯（圖 3F 至 K）。具體來說，術(shù)后第 2 周，K/M@SM-PA 組的步長(zhǎng)和擺動(dòng)速度值明顯高于 Ctrl 組（P < 0.05）（圖 3F 和 H）。此外，K/M@SM-PA 組大鼠的擺動(dòng)速度值在術(shù)后 2 周已超過正常大鼠（圖 3H）。在擺動(dòng)時(shí)間方面，K/M@SM-PA組大鼠在術(shù)后1周和2周的擺動(dòng)時(shí)間值最低，表明K/M@SM-PA水凝膠治療后大鼠的行走運(yùn)動(dòng)得到了改善，但組間差異不顯著（圖3G）。此外，K/M@SM-PA 組的強(qiáng)度參數(shù)在所有組別中表現(xiàn)出最高水平，包括術(shù)后 4 周的平均強(qiáng)度、最大接觸平均強(qiáng)度和最大接觸最大強(qiáng)度（圖 3I 至 K）。這表明，K/M@SM-PA 治療后，大鼠的站立姿勢(shì)更加穩(wěn)定，疼痛減輕。總之，上述步態(tài)分析表明，在植入生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠后，MTJ 的功能恢復(fù)得到了顯著改善。
圖3 生物活性纖維增強(qiáng)水凝膠促進(jìn)大鼠 MTJ 的功能恢復(fù)
(責(zé)任編輯：admin)
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