《Science Advances》：3D打印生物活性纖維增強水凝膠助力肌腱再生(2)
時間：2024-05-16 08:54 來源：EngineeringForLife 作者：admin 閱讀：次
【體內蛋白質組學揭示生物活性纖維增強水凝膠促進 MTJ 再生的內在機制】
為闡明K/M@SM-PA促進MTJ再生的機制，對術后2周的再生MTJ組織進行了體內無標記蛋白質組學分析。對來自 M@SM-PA 組和 K/M@SM-PA 組的三個獨立重復序列進行了測序，聚類分析后的差異表達蛋白（DEPs）熱圖顯示，這兩組之間的蛋白表達量存在顯著差異（圖 4A）。主成分分析（PCA）顯示，每組的三個重復品都有明顯的聚類（圖 4B）。如火山圖所示，共鑒定出 937 個蛋白質，其中有 193 個上調的 DEPs 和 553 個下調的 DEPs（K/M@SM-PA 與 M@SM-PA）（圖 4C）。為深入了解這些DEPs的功能，研究人員進行了基因本體（GO）富集分析，以揭示發生變化的生物過程（BPs）、細胞成分（CCs）和分子功能（MF）。如圖 4D 所示如圖 4D 所示，上調的 DEPs（K/M@SM-PA 與 M@SM-PA）富集了幾個與 MTJ 再生高度相關的 GO 術語，包括 BP 中的 “肌肉系統過程”、“橫紋肌收縮”、“骨骼肌收縮”、“肌肉結構發育”和“骨骼肌組織發育”；CC 中的“肌球蛋白復合物”、“錨定連接”、“局灶粘附”和 “肌肉-肌腱連接”；以及 MF 中的“肌肉α-肌動蛋白結合”。這些術語大多與骨骼肌的發育和功能維持有關，表明在纖維增強水凝膠系統中加入Klotho能有效促進MTJ缺損中骨骼肌的再生，這與組織學結果一致（圖2B、C、F、H和K）。對上調的 DEPs 進行的 BinGO 分析也顯示了一致的結果。還發現了幾個與肌肉-肌腱界面相關的 CC 術語，包括“錨連接”、“局灶粘附”和“肌腱連接”（圖 4D），這可能與 MTJ 標記表達上調和肌肉-肌腱整合改善有關（圖 2，D 和 I）。在這些術語中，“局灶粘附”和“錨連接”是 MTJ 的關鍵組成部分。它們與肌球蛋白的肌動蛋白絲相連，肌動蛋白絲附著在細胞外的層粘連蛋白上，促進了肌纖維與肌腱 ECM 的錨定。然而，可能由于缺乏足夠的肌腱特征標記物，沒有肌腱特異性術語被富集。為克服 DEP 富集分析的局限性，還對所有鑒定出的蛋白質進行了基因組富集分析（GSEA）。結果顯示，在比較 K/M@SM-PA 和 M@SM-PA 時，多個與肌肉相關的 BP、CC 和 MF 術語發生了顯著變化（圖 4E），證實了 Klotho 在促進肌肉再生方面的顯著作用，這與之前的報道一致。
圖4 體內全局蛋白質組學揭示了生物活性纖維增強水凝膠促進 MTJ 再生的內在機制
【生物活性纖維增強型水凝膠可促進細胞存活并支持移植間充質干細胞的成腱/成肌分化】
為證實 Klotho- 加入生物活性纖維增強水凝膠對間葉干細胞存活的保護作用，在體外應用 H2O2 和 IL-1β 刺激誘導細胞氧化應激，模擬損傷 MTJ 的病理環境。采用 2′，7′-二氯熒光素-二乙酸酯（DCFH-DA）測定和定量聚合酶鏈反應（qPCR）來評估水凝膠系統的抗氧化活性。間充質干細胞經H2O2或IL-1β處理后，H2O2-或IL-1β處理組的ROS陽性細胞較Ctrl組（未經H2O2或IL-1β處理）顯著增加，證實H2O2和IL-1β處理能有效促進ROS生成并誘導間充質干細胞氧化應激（圖5A和B）。代表性圖像和定量分析顯示，H2O2/IL-1β + K@SM-PA 水凝膠處理的間充質干細胞在 H2O2- 和 IL-1β 誘導的 ROS 模型中的 ROS 陽性細胞率分別為 11.71 ± 0.77% 和 23.02 ± 7.63%，明顯低于 H2O2/IL-1β 處理的間充質干細胞（H2O2-94.15±1.56%，P＜0.0001；IL-1β為96.67±0.68%，P＜0.0001）和H2O2/IL-1β+SM-PA水凝膠（H2O2為86.05±5.86%，P＜0.0001；IL-1β為96.91±1.93%，P＜0.0001）（圖5A和B）。
qPCR結果顯示，H2O2刺激后，超氧化物歧化酶-1（SOD-1）、錳依賴性超氧化物歧化酶（MnSOD，又稱SOD-2）和過氧化氫酶（CAT）的表達水平在H2O2組和H2O2+SM-PA組明顯升高（圖5C至E），表明間充質干細胞受到的氧化應激增加，激活了其內在的抗氧化防御系統。這與之前的一項研究一致，該研究用各種促氧化劑（包括 H2O2、百草枯和甲萘醌）處理 C2C12 肌肉細胞系，發現 C2C12 細胞會激活抗氧化防御系統以應對氧化應激，表現出幾種抗氧化酶的表達顯著增加，包括 MnSOD、CAT、Cu/Zn-超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶。相比之下，與 H2O2 組和 H2O2 + SM-PA 組相比，H2O2 + K@SM-PA 組的間充質干細胞在 Klotho 處理后受到的氧化應激水平較低（圖 5C 至 E），SOD-1、SOD-2 和 CAT 的表達明顯降低就是證明。這些結果表明，負載有 Klotho 的纖維增強水凝膠具有顯著的抗氧化生物活性，能有效清除病理微環境中的 ROS。
圖5 生物活性纖維增強水凝膠通過抑制氧化應激提高細胞存活率并支持間充質干細胞分化
【生物活性纖維增強水凝膠通過抑制氧化應激維持肌母細胞和肌腱干細胞的表型】
本研究的體內蛋白質組學數據顯示，K/M@SM-PA水凝膠可以抑制氧化應激和炎癥反應，從而維持內源性和外源性細胞的表型和功能，啟動MTJ的再生過程（圖4）。除了移植的間充質干細胞外，MTJ 內的常駐細胞群也能對生物活性纖維增強水凝膠改善的微環境做出反應，從而啟動 MTJ 再生的細胞過程。鑒于生物活性纖維增強水凝膠對移植間充質干細胞的抗氧化作用已得到證實，本研究將評估范圍擴大到分別代表肌肉和肌腱組織內細胞的 C2C12 細胞和肌腱干/祖細胞（TSPCs）（圖 6A）。同樣，C2C12和TSPCs受到H2O2和IL-1β的刺激，并進行DCFH-DA檢測以評估細胞內的ROS。當用 H2O2/IL-1β 和 H2O2/IL-1β + SM-PA 處理時，C2C12 和 TSPCs 表現出的 ROS 陽性細胞數量明顯高于對照組，證實了這兩種細胞中氧化應激的成功誘導（圖 6B 至 E）。研究發現，與 H2O2 + SM-PA 組相比，H2O2 + K@SM-PA 組的兩類細胞的 ROS 生成量都大大降低（圖 6B 和 C）。C2C12（1.77 ± 1.26% 對 17.44 ± 2.78%，P < 0.05）和 TSPCs（4.66 ± 2.11% 對 55.27 ± 9.93%，P < 0.0001）中的 ROS 陽性細胞率均有所下降（圖 6F 和 G）。此外，在IL-1β刺激模型中，在C2C12和TSPCs中也觀察到了類似但更顯著的效果，與SM-PA水凝膠相比，K@SM-PA水凝膠中C2C12（1.42±0.61%對22.33±3.76%，P＜0.001）和TSPCs（3.80±2.01%對67.28±7.53%，P＜0.0001）的ROS陽性細胞率顯著降低（圖6D、E、H和I）。這些結果共同證實了所開發的纖維增強水凝膠對肌肉和肌腱系細胞具有很強的抗氧化能力。
圖6 生物活性纖維增強水凝膠通過抑制氧化應激維持 C2C12 和 TSPC 的功能表型
【生物活性纖維增強水凝膠引導巨噬細胞從促炎表型極化為抗炎表型】
本研究采用了常用的 M1 型巨噬細胞極化誘導劑脂多糖（LPS）（圖 7A）。IF 染色顯示，與 Ctrl 組相比，LPS 刺激可顯著上調巨噬細胞中誘導型一氧化氮合酶（iNOS）（M1 標志物）的表達水平（P < 0.01），而 CD206 和精氨酸酶-1（ARG-1）（M2 標志物）的表達則明顯下降，證實了 LPS 誘導后巨噬細胞的 M1 極化（圖 7B 至 E）。與 LPS 組（P < 0.05）和 SM-PA 組（P < 0.05）相比，K@SM-PA 組的 iNOS 蛋白表達水平大幅下降（圖 7B 和 E）。相反，與 LPS 組和 SM-PA 組相比，K@SM-PA 組 M2 標志物（CD206 和 ARG-1）的蛋白表達明顯升高，如圖 7（C 至 E）所示。與此相一致，本研究發現 K@SM-PA 水凝膠可部分減輕 LPS 刺激后 CCR-7 表達的增加，而 SM-PA 水凝膠則不能（圖 7F）。同時，與 LPS 組（P < 0.05）和 SM-PA 組（P < 0.05）相比，K@SM-PA 水凝膠誘導的 CD206 表達量明顯增加（圖 7F）。IL-10的表達也有類似的趨勢，但沒有顯著差異（圖7F）。總之，這些結果表明，Klotho負載的纖維增強水凝膠通過引導巨噬細胞從M1表型極化到M2表型發揮了抗炎作用。
圖7 生物活性纖維增強型水凝膠引導巨噬細胞從 M1 表型極化到 M2 表型
本研究開發了一種纖維增強水凝膠，它能為力傳導提供足夠的機械支持，同時具有免疫調節和抗氧化生物活性，以改善具有挑戰性的損傷后微環境，最終調節外源性和內源性細胞的行為，促進體內 MTJ 的結構和功能再生（圖 8）。3D打印的 PLGA 支架的排列結構使水凝膠系統具有接近于原生 MTJ 的強大機械性能，可有效支持肌肉-肌腱界面的力傳遞，從而維持 MTJ 再生過程中的生理功能。在水凝膠系統中加入 Klotho 可減輕氧化應激和炎癥反應，從而創造一個有利于再生的微環境，保護 MTJ 損傷中各種細胞群的功能和表型。它能提高移植間充質干細胞的存活率，并支持其多向分化能力，可能有助于在隨后的肌肉和肌腱再生過程中增強肌源性/腱源性分化。此外，改善的微環境還能維持 MTJ 中常駐肌腱/肌肉細胞的功能表型，并調節巨噬細胞向抗炎表型的極化。
圖8 促進 MTJ 再生的生物活性纖維增強水凝膠示意圖
2. 總結與展望
本研究開發了一種生物活性纖維增強水凝膠，它具有足夠的機械強度、抗氧化和免疫調節生物活性、干細胞遞送特性和內源性細胞調節功能，可同時促進MTJ的結構和功能再生。在這種水凝膠系統中，帶有排列整齊纖維的3D打印聚乳酸（PLGA）支架賦予了水凝膠足夠的機械強度，以維持 MTJ 的生理功能。由于 Klotho 的加入抑制了氧化應激，該支架為移植間充質干細胞的存活和分化提供了有利的微環境，同時保持了 TSPCs 和肌母細胞的功能表型特征，從而啟動了 MTJ 的再生過程。此外，它還具有免疫調節功能，能使巨噬細胞從促炎的 M1 表型恢復到抗炎的 M2 表型。與以往主要在體外進行的 MTJ 組織工程研究不同，本研究定制了一個優化的細胞微環境，以調節體內不同的細胞群，從而增強 MTJ 的結構修復和功能恢復。本研究獲得的啟示為未來治療 MTJ 損傷帶來了巨大希望。
文章來源：
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adm7164
(責任編輯：admin)
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