3D打印作為擴大T細胞制造生物混合水凝膠規模的策略
時間：2024-10-16 08:54 來源： EngineeringForLife 作者：admin 閱讀：次
細胞免疫治療的出現為對抗癌癥、自身免疫疾病和傳染病帶來了更高效的策略。然而，這些治療相關的細胞制造過程仍然昂貴且耗時，限制了它們的應用范圍。最近，受淋巴結啟發的PEG-肝素水凝膠被證明能夠改善實驗室規模下的原始人類T細胞培養。
為了進一步推動其臨床應用，來自西班牙巴塞羅那自治大學(UAB)材料研究所(ICMAB-CSIC)的Judith Guasch等團隊評估了其可擴展性，并通過3D打印成功實現。因此，我們能夠提高原始人類T細胞在生物混合PEG-肝素水凝膠中的浸潤能力，同時增加營養、廢物和氣體的傳輸，從而在保持表型的同時提高了原始人類T細胞的增殖率。因此，本文向滿足改進細胞免疫療法中所用細胞產品制造的要求邁出了一步。相關工作以題為“3D Printing as a Strategy to Scale-Up Biohybrid Hydrogels for T Cell Manufacture”的文章發表在2024年09月16日的期刊《ACS Applied Materials & Interfaces》。
1.創新型研究內容
3D打印允許通過逐層方法自動化制造復雜結構的3D物體，這些結構具有精確設計的幾何形狀。在不同類型的3D打印技術中，擠出基打印在生物醫學領域尤其流行，因為它簡單地包括通過噴嘴擠出材料并將其以絲狀形式沉積在平臺上，以形成3D結構。為了在制造人工淋巴結方面向前邁出一步，并幫助克服當前與大量治療性T細胞制造相關的ACT限制，之前描述的PEG-肝素水凝膠被分析作為3D打印的墨水，并用于人類T細胞培養（圖1）。
【PEG-肝素水凝膠作為3D打印的墨水】
為了優化營養、氣體和廢物交換，以最大化細胞存活率和增殖，選擇了3D支架設計。該設計保持了水凝膠固有的微米級孔隙度，其有效性之前已得到證明。此外，選擇了一種簡單的設計，這種設計常用于評估新材料，由四層網格組成，線條間距為1.5毫米（圖2A）。其簡單性也有助于其轉化潛力和技術轉移選項。為此，PEG-肝素水凝膠被預先成型并測試作為3D打印的墨水，在室溫下和不同的水凝膠形成時間進行。混合兩種組分4小時后，4臂PEG硫醇和馬來酰亞胺功能化的肝素樣本達到了足夠的粘度，可以進行打印（圖2B）。然而，所得支架顯示出一致性低，打印網格中的線條分化不良。為了提高其質量，預成型的水凝膠在混合后12小時使用，得到了適合本文目的的支架（圖2C）。最后，本文還評估了將PEG-肝素水凝膠溶解在細胞培養基中進行潛在載細胞實驗的可能性。在這種情況下，水凝膠的形成立即發生，可能是由于存在較少的二價離子，這促進了二硫鍵的形成，從而減少了可用于水凝膠形成的硫醇。有趣的是，所得材料可以很容易地打印（圖2D）。
【PEG-肝素印跡支架用于CD4+ T細胞擴增】
一旦證明了PEG-肝素水凝膠的可打印性，就打印并評估了3D層狀結構作為初級人CD4+ T細胞培養的3D支架。作為起點，使用約35和50微克的材料，分別制造了由4層或6層組成的支架，每條線之間的間隔為1.5毫米。然后，以每毫升106個細胞的濃度，將初級人CD4+ T細胞接種在它們上面，培養6天。接著，通過流式細胞術獲得了樣品和對照（懸浮培養的細胞）的增殖、復制和擴增指數（32），并進行比較（見圖3A–C）。
在下一步中，分析了兩種類型的3D打印水凝膠在接種后5天產生的T細胞的表型。特別是，細胞被分類為初始型（TN；CD45RO-/CD62L+）、中心記憶型（TCM；CD45RO+/CD62L+）、效應型（TEFF；CD45RO-/CD62L-）和效應記憶型（TEM；CD45RO+/CD62L-）。對于四層水凝膠（圖3D），觀察到TCM表型的百分比顯著增加，同時TEM減少。具體來說，四層打印水凝膠的TCM中位值為66%，陽性對照為61%，而陰性對照為45%。此外，打印支架的TEM平均值為23%，與陽性對照的30%和陰性對照的14%相比。最后，TN細胞從失活細胞的39%顯著減少到懸浮培養或使用水凝膠培養的細胞的5%和6%，盡管激活細胞之間沒有獲得顯著差異。盡管對于六層支架也觀察到了類似的趨勢，但觀察到的差異不太明顯，特別是對TCM表型而言（圖3E）。
【通過3D打印技術擴大水凝膠的尺寸】
最近的研究已經證明，使用PEG-肝素水凝膠可以改善免疫細胞的培養效果，包括增殖和分化，這對于如ACT等細胞療法來說是有趣的結果。然而，這些治療需要培養體積可能達到升的量級，而目前的結果是在不到1毫升的體積下取得的。因此，有必要擴大水凝膠的尺寸以實現其臨床應用。但是，支架尺寸的增加肯定會使細胞、營養物質和氣體的傳輸更加困難。為了解決這個問題，本文研究了使用3D打印技術來擴大支架尺寸的方法。因此，本文選擇了一個直徑更大的針頭（25G）并比較了其與之前的針頭的可打印性。在這兩種情況下，通過將預先形成的PEG-肝素水凝膠通過針頭擠出并打印片段，獲得了連續的纖維（圖4A, B）。如本文所預期的那樣，使用更大針頭得到的纖維直徑顯著增加（圖4C）。
此外，擴散比也從1.68 ± 0.35（27G）增加到2.49 ± 0.41（25G），在兩種情況下都是可以接受的，因為它們都在1到3之間。（33）此外，通過設計一個由十層組成的圓形網格結構，每層之間的線條間隔為1.5毫米，并以交替的方式垂直排列，對結構進行了修改（圖5A）。這種新設計使我們能夠將打印材料的數量增加10倍。為了進一步表征新設計，本文采用X射線微計算機斷層掃描成像和環境掃描電子顯微鏡（SEM）來測量打印水凝膠的孔徑和互連性（圖5B, C）。正如圖像所示，可以看到分層結構以及之前在大塊水凝膠中觀察到的水凝膠內部結構。
此外，通過流變學測量了支架的機械性能（圖S3），并與未打印材料進行了比較。打印水凝膠的儲能模量（G′）為447 ± 34 Pa，而未打印水凝膠的儲能模量為1.1 ± 0.1 kPa。如預期的那樣，與大塊水凝膠中的相同材料相比，打印水凝膠在打印時失去了部分硬度。然而，兩種水凝膠類型的機械性能是可比的，打印的水凝膠提供了更好的細胞進入材料內部的可及性，與大塊水凝膠相比，提供了更好的機會來擴大這種材料的使用規模。最后，大型3D打印水凝膠被用于培養原代人類CD4+T細胞（圖6）。為了確定打印結構的優勢，本文將結果與相同質量但未打印的水凝膠（大塊結構）進行了比較。
2.總結與展望
本文證明了PEG-肝素水凝膠可以成功進行3D打印，這為包括載細胞結構在內的眾多潛在應用打開了大門。此外，與懸浮培養相比，在打印支架中孵育的原始人類CD4+ T細胞的增殖得到了增強，6層支架的增殖率高于四層支架。另外，這些3D打印的水凝膠在第5天時增加了TCM細胞的百分比，這是一種與免疫治療高效性相關的表型。最后，生產了大型3D打印水凝膠以評估PEG-肝素實驗室水凝膠的可擴展性，因此，它們作為ACT所需的免疫細胞培養用3D支架的潛在用途。在這些實驗中，與最先進的懸浮方法和整體水凝膠相比，3D打印水凝膠獲得了更高的增殖比率。這些結果可以通過3D打印水凝膠與整體水凝膠相比，細胞、廢物、營養和氣體向內部傳輸的增強來解釋。因此，我們展示了將材料優勢與3D打印技術優勢相結合，可能產生在臨床上有用的PEG-肝素水凝膠。
為了進一步推動其臨床應用，來自西班牙巴塞羅那自治大學(UAB)材料研究所(ICMAB-CSIC)的Judith Guasch等團隊評估了其可擴展性，并通過3D打印成功實現。因此，我們能夠提高原始人類T細胞在生物混合PEG-肝素水凝膠中的浸潤能力，同時增加營養、廢物和氣體的傳輸，從而在保持表型的同時提高了原始人類T細胞的增殖率。因此，本文向滿足改進細胞免疫療法中所用細胞產品制造的要求邁出了一步。相關工作以題為“3D Printing as a Strategy to Scale-Up Biohybrid Hydrogels for T Cell Manufacture”的文章發表在2024年09月16日的期刊《ACS Applied Materials & Interfaces》。
1.創新型研究內容
3D打印允許通過逐層方法自動化制造復雜結構的3D物體，這些結構具有精確設計的幾何形狀。在不同類型的3D打印技術中，擠出基打印在生物醫學領域尤其流行，因為它簡單地包括通過噴嘴擠出材料并將其以絲狀形式沉積在平臺上，以形成3D結構。為了在制造人工淋巴結方面向前邁出一步，并幫助克服當前與大量治療性T細胞制造相關的ACT限制，之前描述的PEG-肝素水凝膠被分析作為3D打印的墨水，并用于人類T細胞培養（圖1）。
圖1 使用3D打印水凝膠進行細胞培養的自體T細胞產品制造簡化方案
【PEG-肝素水凝膠作為3D打印的墨水】
為了優化營養、氣體和廢物交換，以最大化細胞存活率和增殖，選擇了3D支架設計。該設計保持了水凝膠固有的微米級孔隙度，其有效性之前已得到證明。此外，選擇了一種簡單的設計，這種設計常用于評估新材料，由四層網格組成，線條間距為1.5毫米（圖2A）。其簡單性也有助于其轉化潛力和技術轉移選項。為此，PEG-肝素水凝膠被預先成型并測試作為3D打印的墨水，在室溫下和不同的水凝膠形成時間進行。混合兩種組分4小時后，4臂PEG硫醇和馬來酰亞胺功能化的肝素樣本達到了足夠的粘度，可以進行打印（圖2B）。然而，所得支架顯示出一致性低，打印網格中的線條分化不良。為了提高其質量，預成型的水凝膠在混合后12小時使用，得到了適合本文目的的支架（圖2C）。最后，本文還評估了將PEG-肝素水凝膠溶解在細胞培養基中進行潛在載細胞實驗的可能性。在這種情況下，水凝膠的形成立即發生，可能是由于存在較少的二價離子，這促進了二硫鍵的形成，從而減少了可用于水凝膠形成的硫醇。有趣的是，所得材料可以很容易地打印（圖2D）。
圖2 為優化PEG-肝素水凝膠的3D打印而設計的支架示意圖
【PEG-肝素印跡支架用于CD4+ T細胞擴增】
一旦證明了PEG-肝素水凝膠的可打印性，就打印并評估了3D層狀結構作為初級人CD4+ T細胞培養的3D支架。作為起點，使用約35和50微克的材料，分別制造了由4層或6層組成的支架，每條線之間的間隔為1.5毫米。然后，以每毫升106個細胞的濃度，將初級人CD4+ T細胞接種在它們上面，培養6天。接著，通過流式細胞術獲得了樣品和對照（懸浮培養的細胞）的增殖、復制和擴增指數（32），并進行比較（見圖3A–C）。
在下一步中，分析了兩種類型的3D打印水凝膠在接種后5天產生的T細胞的表型。特別是，細胞被分類為初始型（TN；CD45RO-/CD62L+）、中心記憶型（TCM；CD45RO+/CD62L+）、效應型（TEFF；CD45RO-/CD62L-）和效應記憶型（TEM；CD45RO+/CD62L-）。對于四層水凝膠（圖3D），觀察到TCM表型的百分比顯著增加，同時TEM減少。具體來說，四層打印水凝膠的TCM中位值為66%，陽性對照為61%，而陰性對照為45%。此外，打印支架的TEM平均值為23%，與陽性對照的30%和陰性對照的14%相比。最后，TN細胞從失活細胞的39%顯著減少到懸浮培養或使用水凝膠培養的細胞的5%和6%，盡管激活細胞之間沒有獲得顯著差異。盡管對于六層支架也觀察到了類似的趨勢，但觀察到的差異不太明顯，特別是對TCM表型而言（圖3E）。
圖3 在打印的PEG-肝素水凝膠中培養6天的初級人類CD4+ T細胞的標準化增殖結果，水凝膠高度為4層或6層，以及懸浮培養（陽性對照）
【通過3D打印技術擴大水凝膠的尺寸】
最近的研究已經證明，使用PEG-肝素水凝膠可以改善免疫細胞的培養效果，包括增殖和分化，這對于如ACT等細胞療法來說是有趣的結果。然而，這些治療需要培養體積可能達到升的量級，而目前的結果是在不到1毫升的體積下取得的。因此，有必要擴大水凝膠的尺寸以實現其臨床應用。但是，支架尺寸的增加肯定會使細胞、營養物質和氣體的傳輸更加困難。為了解決這個問題，本文研究了使用3D打印技術來擴大支架尺寸的方法。因此，本文選擇了一個直徑更大的針頭（25G）并比較了其與之前的針頭的可打印性。在這兩種情況下，通過將預先形成的PEG-肝素水凝膠通過針頭擠出并打印片段，獲得了連續的纖維（圖4A, B）。如本文所預期的那樣，使用更大針頭得到的纖維直徑顯著增加（圖4C）。
圖4 在空氣中擠出的水凝膠和用27G和25G針頭打印的纖維的代表圖像
此外，擴散比也從1.68 ± 0.35（27G）增加到2.49 ± 0.41（25G），在兩種情況下都是可以接受的，因為它們都在1到3之間。（33）此外，通過設計一個由十層組成的圓形網格結構，每層之間的線條間隔為1.5毫米，并以交替的方式垂直排列，對結構進行了修改（圖5A）。這種新設計使我們能夠將打印材料的數量增加10倍。為了進一步表征新設計，本文采用X射線微計算機斷層掃描成像和環境掃描電子顯微鏡（SEM）來測量打印水凝膠的孔徑和互連性（圖5B, C）。正如圖像所示，可以看到分層結構以及之前在大塊水凝膠中觀察到的水凝膠內部結構。
圖5 為最大化支架尺寸而設計的3D打印水凝膠的示意圖和照片圖像，其直徑為1厘米，以及所用材料的數量
此外，通過流變學測量了支架的機械性能（圖S3），并與未打印材料進行了比較。打印水凝膠的儲能模量（G′）為447 ± 34 Pa，而未打印水凝膠的儲能模量為1.1 ± 0.1 kPa。如預期的那樣，與大塊水凝膠中的相同材料相比，打印水凝膠在打印時失去了部分硬度。然而，兩種水凝膠類型的機械性能是可比的，打印的水凝膠提供了更好的細胞進入材料內部的可及性，與大塊水凝膠相比，提供了更好的機會來擴大這種材料的使用規模。最后，大型3D打印水凝膠被用于培養原代人類CD4+T細胞（圖6）。為了確定打印結構的優勢，本文將結果與相同質量但未打印的水凝膠（大塊結構）進行了比較。
圖6 在播種后6天，懸浮培養的初級人類CD4+ T細胞（陽性對照）、大塊非打印PEG-肝素水凝膠（10x N.P）和大塊3D打印PEG-肝素水凝膠（10x 3D P）的標準化增殖結果
2.總結與展望
本文證明了PEG-肝素水凝膠可以成功進行3D打印，這為包括載細胞結構在內的眾多潛在應用打開了大門。此外，與懸浮培養相比，在打印支架中孵育的原始人類CD4+ T細胞的增殖得到了增強，6層支架的增殖率高于四層支架。另外，這些3D打印的水凝膠在第5天時增加了TCM細胞的百分比，這是一種與免疫治療高效性相關的表型。最后，生產了大型3D打印水凝膠以評估PEG-肝素實驗室水凝膠的可擴展性，因此，它們作為ACT所需的免疫細胞培養用3D支架的潛在用途。在這些實驗中，與最先進的懸浮方法和整體水凝膠相比，3D打印水凝膠獲得了更高的增殖比率。這些結果可以通過3D打印水凝膠與整體水凝膠相比，細胞、廢物、營養和氣體向內部傳輸的增強來解釋。因此，我們展示了將材料優勢與3D打印技術優勢相結合，可能產生在臨床上有用的PEG-肝素水凝膠。
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