在組織工程與再生醫學領域，液滴生物打印技術因具有高分辨率、非接觸式操作等優勢而備受關注，但其依賴低黏度生物墨水，導致打印結構缺乏自支撐性，難以構建復雜3D立體結構，且多材料圖案化需繁瑣的層間交聯步驟，限制了應用場景。來自哈佛醫學院的Yu Shrike Zhang教授團隊開發了一種液滴3D低溫生物打印技術，通過將液滴打印與低溫打印結合，利用低溫板（-5至-15℃）使低黏度生物墨水（如7.5% GelMA）在沉積后立即凍結，無需額外支撐即可形成自立式結構，同時避免多材料混合問題。該技術成功打印出金字塔、多層網格及字母“H”“V”等單材料或多材料復雜結構，并實現了C2C12肌成纖維細胞、NIH/3T3成纖維細胞等多種細胞的封裝，細胞存活率在培養2-3周后達80%-90%，還構建了血管化乳腺癌模型驗證多細胞共培養潛力。相關工作以“Droplet 3D cryobioprinting for fabrication of free﹕tanding and volumetric structures”為題發表在《Aggregate》上。
 

研究內容
1. 液滴低溫生物打印機示意圖及可實現的結構示例，通過自主搭建的雙微閥低溫打印系統，結合壓力調控（100-300 mbar）與低溫板（-5至-15℃）凍結技術，研究了低黏度生物墨水（7.5% GelMA）的3D打印能力。結果表明，系統可生成1-10 nL穩定液滴，通過單/多材料噴射成功構建金字塔、多層網格及字母“H”“V”等自立式結構，驗證了低溫凍結對維持低黏度墨水空間形態的關鍵作用，避免傳統液滴打印的擴散坍塌問題。   
 

2. 液滴尺寸與打印高寬比量化分析圖，利用光學成像系統（SmartDrop）和流變儀，研究了壓力、閥門開啟時間（500-700 µs）及打印頻率（0.1-20 Hz）對液滴體積和結構高寬比的影響。結果顯示，低壓力（100 mbar）與短開啟時間（500 µs）產生最小液滴（0.8 nL），低溫板溫度越低（如-15℃）、頻率越低（如0.1 Hz），結構高寬比越高（>4），且凍結后水凝膠儲存模量從室溫的0.01 Pa·s躍升至50 Pa·s以上，揭示了低溫通過增強材料彈性維持打印結構穩定性的機制。   
 

3. 細胞封裝存活率與形態演變圖，通過活/死染色（Calcein-AM/PI）和免疫熒光染色（F-actin/DAPI），研究了C2C12肌細胞、NIH/3T3成纖維細胞在-5℃/-10℃打印后的存活與增殖行為。結果表明，初始存活率約50%，培養14天后升至80%-90%，細胞呈擴散生長并形成互連網絡；星形膠質細胞在3%低濃度GelMA中鋪展面積更大（14天達初始3倍），但結構穩定性隨濃度降低而下降，提示需平衡細胞活性與力學性能。   
 

4. 不同GelMA濃度下星形膠質細胞打印表征圖，通過對比3%與7.5% GelMA濃度，研究了水凝膠剛度對星形膠質細胞行為的影響。結果顯示，3% GelMA組第7天存活率（80%）顯著高于7.5%組（60%），細胞覆蓋面積在14天達到7.5%組的2.3倍，但低濃度水凝膠在培養后期出現輕微結構坍塌，表明軟基質促進細胞鋪展但需優化長期穩定性。   
 

5. 多材料空間異質性結構打印圖，利用雙微閥系統加載熒光染料標記的GelMA，研究了多材料分層打印的可行性。結果表明，低溫凍結可防止不同材料混合，成功打印交替層狀網格結構，界面清晰無擴散；進一步構建MCF-7腫瘤細胞與HUVEC血管內皮細胞的共培養模型，證明兩種細胞在21天內保持空間分隔并正常增殖，驗證了模擬復雜組織微環境的能力。   
 

6. 血管化乳腺癌模型共培養表征圖，通過分層打印兩層MCF-7細胞（2.5×10⁶ cells/mL）與兩層GFP標記HUVECs（5×10⁶ cells/mL），研究了多細胞類型的空間分布與相互作用。結果顯示，HUVECs在腫瘤細胞層上方形成血管樣結構，培養21天后交界處可見內皮細胞向腫瘤細胞方向萌芽，兩組細胞存活率分別達90%和80%，證實該技術在構建血管化腫瘤模型中的應用潛力。   
 

研究結論
     本研究開發了液滴3D低溫生物打印技術，融合液滴打印與低溫凍結，解決了傳統液滴打印難以構建復雜3D自立結構的難題。系統可生成1-10 nL液滴，通過-5至-15℃低溫板實現低黏度水凝膠（如7.5% GelMA）的快速固化，成功打印單/多材料立體結構（如金字塔、血管化腫瘤模型），結構高寬比最高達4以上。細胞封裝實驗表明，C2C12、NIH/3T3等細胞在打印后培養14天存活率達80%-90%，星形膠質細胞在3%低濃度水凝膠中鋪展更佳。多材料打印證實該技術可精準控制細胞空間分布，構建的血管化乳腺癌模型中腫瘤細胞與內皮細胞保持功能活性。本研究為復雜組織工程結構和多細胞共培養模型的構建提供了新方法，但其在大尺寸結構打印和細胞長期活性調控方面仍需優化。

文章來源：
https://doi.org/10.1002/agt2.599

(責任編輯：admin)

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