中國醫科大學張忠提團隊發表用于骨再生的3D生物打印仿生MOF功能化水凝膠支架
時間：2025-06-19 10:53 來源：南極熊 作者：admin 閱讀：次
臨界尺寸的骨缺損仍是一項重大的臨床挑戰。缺損區域缺乏具有成骨分化潛能的內源性干細胞，再加上支架植入誘發的炎癥反應，突出了對可輸送干細胞并具有炎癥調節特性的生物材料的需求。中國醫科大學張忠提團隊基于3D生物打印技術，構建了負載木犀草素-ZIF-8納米顆粒的GelMA水凝膠支架(LUT@ZIF-8/GelMA)。該文章名為“3D bioprinted biomimetic MOF-functionalized hydrogel scaffolds for bone regeneration: Synergistic osteogenesis and osteoimmunomodulation”，發表在Materials Today Bio上。該支架表現出優異的物理性能和生物相容性。LUT@ZIF-8納米顆粒中木犀草素和鋅離子的持續釋放賦予了其抗菌、成骨誘導和炎癥調控作用。LUT@ZIF-8/GelMA水凝膠支架調控的免疫微環境促進了BMSCs的成骨分化。此外，體內實驗證實了LUT@ZIF-8/GelMA水凝膠支架的成骨和炎癥調控能力。總之，這種3D生物打印的LUT@ZIF-8/GelMA水凝膠支架具有骨免疫調節特性，為骨缺損的治療提供了一種有前景的策略。
一、背景介紹
臨界尺寸骨缺損(CSBDs)的臨床修復面臨內源性干細胞匱乏與炎癥微環境雙重挑戰。本研究融合3D生物打印與骨免疫調控策略，構建多功能LUT@ZIF-8/GelMA水凝膠支架，以ZIF-8納米顆粒負載木犀草素提升藥物緩釋性能，協同Zn²⁺釋放實現抗菌-成骨-免疫調節三重功效。優化GelMA水凝膠力學性能，通過RGD基序促進骨髓間充質干細胞(rBMSCs)黏附增殖。體外實驗證實支架可誘導巨噬細胞M2極化，分泌IL-4/IL-10等抗炎因子，逆轉炎癥微環境對成骨分化的抑制。體內顱骨缺損模型顯示支架顯著促進新生骨形成，Micro-CT與組織學分析證實其骨再生效率優于對照組。該研究為骨組織工程提供了兼具干細胞遞送與免疫微環境重塑功能的智能化修復平臺。
圖1. 用于骨再生的LUT@ZIF-8/GelMA生物打印支架的示意圖。
二、材料和方法
2.1 3D水凝膠支架的生物打印
LUT@ZIF-8/GelMA生物墨水的制備流程如下：首先將50 mg苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸鋰(EFL，中國)溶于10 mL PBS溶液，45℃間歇攪拌15 min。隨后將500 mg GelMA(EFL，中國)加入5 mL LAP溶液中，65℃避光加熱15 min。滅菌后，將LUT@ZIF-8納米顆粒懸液按1:1(v/v)與GelMA溶液混合，超聲處理5 min形成均質生物墨水。使用23G針頭的5 mL注射器裝載生物墨水，置于3D生物打印機BM2i(Sunp，中國)中，設置打印頭與平臺溫度分別為18-22℃和18℃，打印速度與擠出速度分別為5 mm/min和2 mm/min。405 nm波長紫外光(0.5 W/cm²)固化成型。封裝rBMSCs時，將細胞以1.5×10⁶cells/mL密度混懸于生物墨水中進行打印。
三、結果與討論
3.1 ZIF-8和LUT@ZIF-8納米顆粒的表征
ZIF-8和LUT@ZIF-8納米顆粒在室溫下成功合成(圖2A)，懸浮液分別呈乳白色和姜黃色(圖2B)。TEM顯示兩者均呈現均勻菱形十二面體形貌，但LUT@ZIF-8粒徑更大且邊緣模糊(圖2C-D)。XRD與FTIR分析表明，LUT@ZIF-8保留了ZIF-8晶體結構特征峰，且未檢測到木犀草素特征峰，證實藥物被有效封裝(圖2F-G)。Zeta電位分析顯示木犀草素負載使納米顆粒表面電荷由+10.5 mV轉為-6.1 mV(圖2H)，有利于成骨分化和免疫調節。
熱重分析顯示LUT@ZIF-8因木犀草素分解產生更大質量損失，羥基與Zn²+配位延緩了早期降解(圖2I)。紫外光譜驗證藥物負載效率達16.72%(圖2J)。pH響應性釋放實驗表明，酸性環境下24小時內釋放達平臺期，中性條件釋放平穩，提示ZIF-8在體液復雜環境中仍可通過水凝膠整合優化緩釋性能(圖2K)。
圖2. ZIF-8和LUT@ZIF-8納米顆粒的表征。
3.2 水凝膠支架的表征
本研究開發了負載LUT@ZIF-8納米顆粒的GelMA生物墨水(圖3A)，通過3D打印構建多孔支架(圖3E)。掃描電鏡顯示支架呈規則網格結構，納米顆粒均勻分散于水凝膠基質(圖3F)。力學測試表明，ZIF-8/GelMA與LUT@ZIF-8/GelMA組彈性模量比純GelMA組有所提升，但木犀草素單獨負載會降低光交聯效率(圖3G-H)。溶脹實驗顯示含ZIF-8組溶脹率較低，24小時達平衡(圖3I)，降解速率適中(圖3J)，為細胞遷移提供空間。藥物緩釋實驗證實LUT@ZIF-8/GelMA支架在14天內持續釋放木犀草素，通過GelMA基質延緩ZIF-8降解，實現長效免疫調控。生物相容性測試顯示0.04% LUT@ZIF-8濃度下rBMSCs存活率最佳(圖3B)，親水性材料特性促進抗炎因子分泌。
圖3. 水凝膠支架的表征。
3.3 水凝膠支架的抗菌性能
針對骨缺損常見感染風險，評估水凝膠支架對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用(圖4A)。菌落計數顯示，LUT@ZIF-8/GelMA與ZIF-8/GelMA組顯著降低菌落數量(圖4B)，24小時后細菌存活率分別下降至23.5%和28.7%(圖4C-D)。活/死菌染色顯示，含ZIF-8組紅色熒光比例顯著增加(圖4E-G)，證實其強效抗菌作用。抗菌機制歸因于Zn²⁺破壞細菌細胞膜，以及木犀草素抑制DNA拓撲異構酶的雙重協同效應。LUT/GelMA組因藥物濃度不足僅表現微弱抗菌活性。
圖4. 水凝膠支架的抗菌活性和生物相容性。
3.4 生物打印支架的生物相容性和細胞毒性
通過生物打印構建載有大鼠骨髓間充質干細胞(rBMSCs)的支架評估其細胞封裝性能，同時制備空白水凝膠支架研究其對巨噬細胞增殖的影響(圖5A)。CCK-8檢測顯示各組細胞增殖隨時間顯著增強，活/死染色證實細胞均勻分布且存活良好(圖5B-C)。第5天TRITC-鬼筆環肽染色顯示LUT@ZIF-8/GelMA組細胞伸展更顯著，表明其更優的細胞擴展性能(圖5D)。第7天所有組別均呈現良好細胞延展，證實水凝膠基質成功模擬細胞外基質特性。RAW264.7細胞實驗表明各組支架3天內均無細胞毒性(圖5E)。結果表明，LUT@ZIF-8納米顆粒在適宜濃度下保持良好生物相容性，生物打印支架既能支持rBMSCs增殖擴展，又不影響巨噬細胞正常增殖。
圖5. 水凝膠支架的生物相容性。
3.5 生物打印支架的體外成骨研究
骨髓間充質干細胞(BMSCs)是骨組織工程的核心種子細胞，既能直接成骨分化，又能通過旁分泌促進組織修復。針對骨缺損區干細胞不足的問題，負載rBMSCs的支架可顯著提升骨再生效果。本研究通過ALP染色、茜素紅(ARS)染色及基因蛋白檢測評估水凝膠支架成骨性能(圖6A)。結果顯示，LUT@ZIF-8/GelMA組ALP活性顯著高于對照組(圖6B-D)，礦化結節密度與成骨基因(RUNX2/COL1A1/ALP/OCN)表達均最優(圖6E-J)，Western blot證實其RUNX2和ALP蛋白表達最高(圖6K-M)。機制上，水凝膠內ZIF-8納米顆粒緩釋Zn²⁺維持最佳濃度，與木犀草素協同增強成骨效應。木犀草素通過Wnt通路促進成骨細胞礦化，而適量Zn²⁺可經TGF-β/PI3K-AKT通路激活BMSCs成骨分化。該研究證實LUT@ZIF-8/GelMA支架通過雙因子控釋體系有效促進骨再生。
圖 6. 水凝膠支架的體外成骨特性。
3.6水凝膠支架對巨噬細胞極化的調控
生物材料植入骨缺損會引發異物反應，其中巨噬細胞的極化狀態對骨修復至關重要。本研究通過免疫熒光染色、流式細胞術及基因檢測評估LUT@ZIF-8/GelMA支架的免疫調控性能(圖7A)。結果顯示，LUT@ZIF-8/GelMA組顯著抑制M1型標志物iNOS表達，同時促進M2型標志物CD206表達(圖7B-C)；流式檢測證實該組M1型巨噬細胞比例最低(圖7E-F)。RT-qPCR分析顯示其下調促炎因子TNF-α/IL-1β，上調抗炎因子IL-4/IL-10(圖7G-J)。支架內木犀草素通過調控STAT3/STAT6磷酸化誘導M2極化，而ZIF-8緩釋的Zn²⁺協同增強該效應，共同構建抗炎微環境。該雙因子控釋體系為骨再生提供了免疫調控新策略。
圖7. 水凝膠支架對巨噬細胞極化的調節。
3.7炎癥調控介導的成骨分化
骨免疫學揭示了巨噬細胞在骨修復中的核心作用：通過直接接觸或分泌外泌體調控間充質干細胞成骨分化。本研究通過構建LPS誘導的炎癥微環境模型，評估LUT@ZIF-8/GelMA支架調控巨噬細胞極化對rBMSCs成骨分化的影響(圖8A)。結果顯示，經該支架處理的巨噬細胞條件培養基顯著提升rBMSCs的ALP活性(圖8B-D)及礦化結節密度(圖8E-F)。RT-qPCR與Western blot證實其成骨基因(RUNX2/COL1A1/ALP/OCN)及蛋白表達均最優(圖8G-M)。機制上，支架釋放的木犀草素與Zn²⁺協同誘導M2型巨噬細胞極化，分泌促修復細胞因子，有效逆轉炎癥微環境對成骨分化的抑制作用。該研究闡明免疫調控-成骨分化級聯機制，為構建免疫微環境響應型骨修復材料提供新思路。
圖8. 炎癥調節介導的成骨分化。
3.8 生物打印支架的體內評估
采用大鼠顱骨缺損模型評估LUT@ZIF-8/GelMA支架的體內免疫調控與成骨性能(圖9A)。術后8周Micro-CT顯示，LUT@ZIF-8/GelMA組骨再生面積最大，LUT/GelMA與ZIF-8/GelMA組次之，GelMA組最弱(圖9B)。骨體積(BV)與骨體積分數(BV/TV)定量分析證實LUT@ZIF-8/GelMA組指標顯著優于對照組(圖9C-D)。
圖9. 體內骨再生評估。
通過H&E/Masson染色及免疫組化評估支架體內成骨效應(圖10A-C)。結果顯示，LUT@ZIF-8/GelMA組缺損區新生骨量最多，RUNX2/OCN表達顯著高于對照組。支架降解良好，殘留極少(圖10A-B)。早期免疫熒光顯示該組iNOS陽性細胞減少而CD206陽性細胞增多，證實其促進M2型極化。重要器官病理切片證實支架植入8周后無毒性損傷。綜上，LUT@ZIF-8/GelMA支架通過誘導M2極化構建促骨生成抗炎微環境，顯著提升骨再生效果。
圖10. 骨再生的組織學分析。
四、結論
本研究針對骨缺損區域內源性干細胞不足與炎癥微環境難題，成功構建了新型LUT@ZIF-8/GelMA水凝膠支架。該支架通過負載LUT@ZIF-8納米顆粒實現木犀草素與Zn²⁺的協同控釋，兼具優異力學性能、抗菌活性及生物相容性，可顯著促進rBMSCs成骨分化并誘導巨噬細胞M2極化以營造促骨生成免疫微環境。體內實驗證實該支架能有效修復臨界尺寸骨缺損，展現出卓越的骨修復潛力，為骨組織工程提供了新型多功能生物材料解決方案。
五、參考文獻
San-yang Yu, Ting Wu, Kai-hao Xu, Ru-yue Liu,Tian-hao Yu, Zhen-hua Wang, Zhong-ti Zhang, 3D bioprinted biomimetic MOF-functionalizedhydrogel scaffolds for bone regeneration: Synergistic osteogenesis andosteoimmunomodulation,Materials Today Bio,Volume 32, 2025,101740,ISSN 2590-0064, https://doi.org/10.1016/j.mtbio.2025.101740.
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