《Biofabrication》：利用明膠和脫細胞骨顆粒組成的生物墨水進行細胞打印
時間：2024-03-28 09:09 來源：EngineeringForLife 作者：admin 閱讀：次
生物制造應用面臨的主要挑戰之一是如何獲得能在可打印性、形狀保真度、細胞活力和組織成熟度之間取得平衡的生物墨水。脫細胞方法可以提取天然細胞外基質，保留組織特異性基質蛋白。然而，骨骼脫細胞的關鍵挑戰在于如何保留有機成分（膠原蛋白、蛋白聚糖）和無機成分（羥基磷灰石），以保持骨骼的天然成分和功能。此外，有必要研究脫細胞骨（DB）顆粒作為一種基于組織的添加劑在生物墨水配方中的作用，以開發功能性生物墨水。
來自土耳其伊茲密爾理工學院的Aylin Kara Özenler 團隊與來自德國埃爾朗根-紐倫堡大學的Aldo R Boccaccini團隊評估了在含有明膠（GEL）和前成骨細胞（MC3T3-E1）或人間充質干細胞（hTERT-MSCs）的生物墨水配方中加入不同大小（≤45 和 ≤100 μm）和濃度（1%、5%、10%（重量百分比））的脫細胞骨顆粒的效果。此外，本研究還提出了一種使用明膠、DB 顆粒和細胞的簡易生物墨水配方，其制備過程簡單，細胞存活率高。本研究對油墨的打印性能進行了評估。此外，還通過剪切稀化和觸變性測試確定了流變特性。生物打印結構經過 28 天的培養。使用生化分析和熒光顯微鏡評估了細胞的活力、增殖和成骨分化能力。DB 顆粒的加入增強了細胞增殖和成骨分化能力，這可能是由于 DB 顆粒含有天然膠原蛋白和羥基磷灰石。使用 DB 粒子后，堿性磷酸酶活性顯著增加，特別是在沒有誘導細胞成骨的情況下。此外，熒光圖像顯示了細胞與材料之間明顯的相互作用以及細胞在結構內部的附著。有了這些充滿希望的結果，目前的簡易生物墨水配方被認為是骨組織工程的潛在候選材料，它是一種可用于臨床的材料，制備簡單，細胞活性高。相關工作以題為“3D bioprinting of mouse pre-osteoblasts and human MSCs using bioinks consisting of gelatin and decellularized bone particles”的文章發表在2024年03月13日的國際知名期刊《Biofabrication》。
1. 創新型研究內容
本研究的目的是開發一種由凝膠、DB 顆粒和細胞組成的最小化生物墨水配方，并評估凝膠基質中不同大小和濃度的 DB 顆粒對細胞行為的影響。研究示意圖如圖 1 所示。在之前的研究中，發現 DB 粒子和 GEL 組合作為生物材料墨水對 MC3T3-E1 前成骨細胞有利。本研究用小鼠前成骨細胞（MC3T3-E1）和人端粒酶逆轉錄酶修飾的間充質干細胞（hTERT-MSCs）測試了 GEL/DB 復合生物墨水配方。在凝膠基質中加入了不同大小和濃度的 DB 粒子，以獲得可打印的配方，同時增強細胞的行為。正如本研究之前所報道的，100 微米的顆粒大小會降低較高顆粒濃度下的可打印性，因此，本研究的假設是，減小顆粒大小可能會增加可打印性，而且細胞行為也會隨著 DB 顆粒濃度的增加而增加。因此，本研究在兩種不同細胞類型的生物墨水配方中評估了不同大小的 DB 粒子的效果。通過與 mTG 交聯，3D生物打印結構的穩定性得以保持。在為期 28 天的培養過程中，對所有3D生物打印細胞負載 GEL/DB 構建物的細胞相容性、生物活性和成骨分化進行了評估。
【流變特性】
本研究對 GEL 和 DB 嵌入式 GEL 生物材料油墨的流變特性進行了評估，以模擬與打印工藝相關的油墨流動條件。每組都進行了剪切稀化試驗，通過將剪切速率從 0 s-1 增加到 100 s-1 來測量粘度。圖 2A 顯示，所有生物材料油墨的粘度都隨著剪切速率的增加而降低，這表明所有材料都表現出適合擠壓式 3D 打印的剪切稀化行為。在剪切速率為 10 s-1 時，GEL 的粘度被測定為 74 Pa.s，與加入 DB 粒子的組相比，差異具有統計學意義（圖 2（B））。此外，添加不同大小和濃度的 DB 粒子也會影響粘度。經測定，GEL/1 DB（100 μm）、GEL/5 DB（100 μm）、GEL/5 DB（45 μm）和 GEL/10%DB （45 μm）的粘度分別為 91.70、111.61、123.84 和 170.67 Pa.s，在統計學上存在顯著差異（圖 2(B)）。與 100 μm 的 DB 顆粒相比，45 μm 的 DB 顆粒增加了油墨的粘度，其統計差異表明較小的顆粒尺寸增強了流變特性。值得注意的是，如圖 2（B）所示，摻入 10% DB 顆粒的油墨粘度更高。這可能是由于油墨內部顆粒之間的相互作用。當復合油墨配方中的固體顆粒之間的相互作用被剪切力破壞時，就會出現剪切變稀的行為。油墨靜止時的粘度較高，這是由懸浮顆粒之間的相互作用重新組織決定的，從而提供了形狀穩定性。因此，較小尺寸的 DB 顆粒濃度越高，懸浮顆粒之間的相互作用就越密集，從而導致粘度越高。此外，在本研究團隊之前的研究中，本研究發現較高的 DB 粒子濃度（>5%）會降低可打印性，而另一方面，高濃度的 DB 粒子有助于細胞生長。本研究發現較小尺寸的 DB 粒子在較高濃度下會增強流變特性，這也是本研究的假設之一。
【3D 打印 GEL/DB 支架】
本研究對 GEL 和 GEL/DB 油墨的可打印性進行了評估。光鏡圖像顯示了用轉谷氨酰胺酶交聯后不同大小和濃度的3D打印 GEL 和 GEL/DB 水凝膠（圖 2(D)）。水凝膠被制成圓柱形，具有交替的 0°/90°支桿結構，從而在支桿之間形成方形大孔。3D打印的 GEL 和 GEL/DB 水凝膠顯示出具有方形孔幾何形狀的良好打印結構（圖 2(D)）。所有墨水都很容易打印，特別是較小尺寸（45 微米）、較高濃度的 DB 粒子有利于打印，這可能是均勻分布在 GEL 基質中的懸浮較小 DB 粒子之間相互作用的結果。盡管純 GEL 水凝膠具有透明度，但顆粒濃度越高，GEL/DB 水凝膠的濁度越高（圖 2(D)）。所有組的打印適性因子（Pr）都是通過公式（1）計算得出的。Pr < 1 表示油墨凝膠不足，孔角呈圓形；Pr = 1 表示凝膠適當，孔幾何形狀呈理想的方形；而 Pr > 1 則表示油墨過度凝膠。所有組的 Pr 因子都接近 1。含有 5%DB 的 GEL 組顯示出較低 Pr 因子（Pr = 0.9 ± 0.04）的圓形孔幾何形狀，與純 GEL 水凝膠相比，本研究發現了統計差異（圖 2（E））。根據之前的報道，當 Pr 因子在 0.9 和 1.1 之間時，3D打印水凝膠會顯示出適當的股形態。因此，5% 的 DB 粒子（100 微米大小）會降低3D打印性能，而 5%的 DB 粒子（45 微米大小）則顯示出最佳打印性能。此外，5% 的 DB 粒子（粒徑為 45 微米）的 Pr 系數為 0.9，具有足夠的打印能力和形狀保真度。與純 GEL 組相比，將顆粒尺寸減小到 45 微米可提高 5% DB 組的可打印性，但在統計上沒有差異。
【生物打印的 MC3T3-E1 前成骨細胞負載 GEL/DB 構建物】
本研究成功制作了負載 1% GEL/DB 構建物的 MC3T3-E1 前成骨細胞，并在細胞培養期間用光學顯微鏡觀察了細胞在構建物內的分布和定位情況。圖 3 顯示了 GEL 和 GEL/DB 結構以及 TCP（組織培養聚苯乙烯）對照組內部的細胞光鏡圖像。在生物打印之前，制備了含有 MC3T3-E1 的2D鑄造 GEL 和 GEL/DB 水凝膠，以觀察水凝膠中的細胞。由于 GEL 水凝膠是完全透明的，因此不易分辨水凝膠的邊緣。如圖 3(A)所示，GEL 和 GEL/DB 水凝膠中的細胞都是可見的，7 d 后可觀察到附著和伸長的細胞（圖 3(A)）。此外，還觀察到細胞附著在 GEL/DB 水凝膠中的 DB 顆粒上（圖 3（A））。在3D生物打印樣品中，MC3T3-E1 細胞分布在 GEL 和 GEL/1% DB 構建物中，并且在細胞培養期間不斷增殖（圖 3(B)）。此外，如圖 3（C）中的放大圖片所示，14 天后，細胞遷移到結構表面，并完全覆蓋了3D生物打印結構。GEL水凝膠在 14 天后會降解，并開始在細胞培養基中失重，這在之前的報道中已有提及。由于 GEL 開始降解，細胞可以在 3D 打印的結構中找到空間并在結構中遷移。在培養期間，隨著結構的降解和細胞的增殖，細胞遷移到結構外，并在細胞培養板上觀察到細胞，如放大圖像所示（圖 3(C)）。此外，GEL 的特定 RGD 序列允許細胞在整個培養期間粘附和增殖，這證明了 GEL 和 GEL/DB 生物墨水配方的細胞相容性。
在3D生物制造結構中，保持細胞活力和3D打印結構的形狀保真度或穩定性是一個重要的關鍵因素。因此，在培養期間對3D生物打印結構中的 MC3T3-E1 細胞進行活/死染色后，對其存活率進行了觀察。熒光顯微鏡圖像顯示了活細胞（綠色）、死細胞（紅色）和細胞核（藍色）（圖 4）。DB 顆粒也因其自發熒光而顯示為藍色/綠色。圖像顯示，MC3T3-E1 細胞在第 7 天時附著在 GEL 和 GEL/DB 構建物內并保持活力（圖 4(A)）。14 天后，細胞在結構中附著和擴散得更多，只觀察到少量死細胞（圖 4(A)）。培養 14 d 后，DAPI 染色顯示細胞核密集。此外，2D細胞負載 GEL 和 GEL/DB 水凝膠中的 MC3T3-E1 細胞在第 14 天仍保持活力（圖 4(B)）。活/死染色結果證實，GEL 和 GEL/DB 墨水配方具有細胞相容性，不會損害 MC3T3-E1 細胞的活力。
在 28 天的培養期內，用 LDH 細胞毒性檢測法評估了油墨可能產生的細胞毒性效應。在2D細胞培養中，細胞釋放的細胞外 LDH 水平相似，在 28 天的培養期內沒有發現統計差異（圖 5(A)）。然而，3D生物打印組在第 1 天的 LDH 水平明顯更高（圖 5(A)）。早期 LDH 水平較高的原因可能是3D生物打印過程中剪切力導致細胞死亡。在隨后的培養天數中，細胞外 LDH 水平持續下降，并具有統計學意義，這表明剩余細胞在后期培養中存活并增殖。MC3T3-E1 細胞的存活率是根據 WST-8 法測定的細胞代謝活性進行量化的，數據顯示，在整個培養過程中，各組細胞的存活率都在逐漸增加（圖5(B)）。此外，3D生物打印 GEL 和 GEL/DB 結構的細胞存活率較高，與2D澆鑄組相比有顯著的統計學差異。此外，與其他組相比，3D生物打印 GEL/DB 結構中的細胞存活率最高（圖 5(B)）。
【細胞增殖和形態】
根據 PicoGreen 檢測法對dsDNA 的定量分析，本研究評估了生物打印結構內部的細胞增殖情況。與根據代謝活性得出的存活率結果（圖 5(B)）一致，生物打印結構內部的細胞數量在細胞培養期間逐漸增加（圖 5(C)）。第一天，生物打印結構中的細胞數量低于2D澆注水凝膠中的細胞數量，這可能是圖 5（A）所示第一天釋放的 LDH 較高的結果。第一天之后，2D澆注水凝膠組的細胞數量在第 7 天有所增加，然后在整個培養期間保持穩定。另一方面，3D生物打印結構中的細胞在 28 天內繼續增殖，與2D水凝膠相比，在第 7 天、14 天和 28 天發現了顯著的統計學差異。此外，在第 21 天，生物打印 GEL/DB 構建物中的細胞數量最多，與3D打印 GEL 組相比，差異有統計學意義（圖 5(C)）。根據細胞毒性、存活率和增殖調查，GEL 和 DB 加入 GEL 的生物墨水為生物打印后的細胞生長提供了3D微環境，作為一種基于天然的最小化生物墨水配方，顯示出良好的效果。
本研究利用熒光顯微鏡評估了3D生物打印結構和2D澆注水凝膠內的細胞粘附性和細胞形態。DAPI 和 F-Actin 染色分別顯示 MC3T3-E1 細胞的細胞核（藍色）和細胞骨架（綠色）。顯微鏡圖像顯示了2D鑄造和3D生物打印結構的細胞粘附情況，以及培養 28 天后細胞與材料的相互作用（圖 5(D)）。2D澆鑄組在第 28 天顯示了細胞與材料的相互作用，細胞覆蓋了 DB 嵌入 GEL 水凝膠內的 DB 顆粒表面（圖 5(D)）。在3D生物打印 GEL/DB 組中，細胞覆蓋了結構，顯示出與 DB 粒子非常積極的相互作用，此外，細胞在第 28 天覆蓋了孔區域，這可以從放大圖像中看到（圖 5(D)）。
【評估不同大小和濃度的 DB 粒子對負載 hTERT-間充質干細胞的3D生物打印 GEL/DB 構建物的細胞行為的影響】
本研究對3D生物打印結構內的細胞存活率通過活/死染色進行了評估。熒光顯微鏡圖像顯示，在 28 天的培養期間，細胞在 GEL 和 GEL/DB 構建物內存活和生長（圖 6）。此外，由于膠原纖維的自發熒光，DB 顆粒顯示出藍色。第一天，在所有組中都觀察到大量存活細胞（綠色），并檢測到細胞集群，特別是在 DB 結合的結構中。由于顆粒密度高且具有自發熒光，hTERT-間充質干細胞在第一天并不清晰可見。然而，大面積的綠色染色，尤其是在 10%的 DB 組中，表明結構內形成了細胞簇（圖 6）。7 天后，細胞開始在生物打印結構中伸長和擴散，之后細胞在 28 天的培養期內保持活力并不斷增殖。hTERT 間充質干細胞的擴散良好，培養 28 d 后觀察到細胞完全覆蓋。此外，活細胞的密度在所有培養日都很高。即使在第 28 天也很難發現死細胞（紅色），這表明油墨配方具有細胞相容性，較高的 DB 粒子濃度有助于細胞生長。
生物打印后，使用 LDH 細胞毒性檢測法對墨水材料的潛在細胞毒性進行量化。將含有細胞的結構培養 28 天，在每個時間點對細胞培養上清液中的細胞外 LDH 釋放量進行量化。結果顯示，在整個培養過程中，各組的 LDH 水平都保持穩定，沒有增加。各時間點和各組之間沒有發現統計學差異，這表明含有 GEL 成分的 DB 對 hTERT-間充質干細胞沒有細胞毒性作用（圖 7(A)）。正如在 GEL 構建物中加入兔 DB 粒子（圖 4 和圖 5）所顯示的那樣，牛 DB 粒子對 hTERT-MSC 也沒有細胞毒性作用。
本研究利用共聚焦顯微鏡詳細評估了3D生物打印結構內部的細胞形態和細胞附著情況。細胞核（藍色）和細胞骨架（綠色）分別采用 DAPI 和 F-Actin 染色（圖 8）。此外，由于 DB 顆粒中纖維膠原的自發熒光，結構內部的 DB 顆粒也清晰可見（呈紅色/粉紅色）。圖像顯示，細胞在第 28 天時在3D生物打印結構內部生長和增殖（圖 8）。細胞在 GEL 和 GEL/DB 構建物內附著并伸長，所有組中都能看到細胞覆蓋的趨勢。值得注意的是，在含有 10% DB 的 GEL 構建物中觀察到了更大的細胞網絡以及與 DB 顆粒的良好互動。這種細胞粘附性表明，細胞與 GEL/DB 組中均勻分布的 DB 顆粒進行了理想的相互作用。
2. 總結與展望
本研究展示了一種由 GEL、DB 顆粒和 MC3T3-E1 前成骨細胞或 hTERT-MSCs組成的最小化生物墨水配方。本研究的主要方法是利用骨組織的天然 ECM 成分，并確定顆粒的理想濃度，以獲得更好的細胞反應。本研究中使用的 DB 顆粒不僅含有膠原纖維，還含有羥基磷灰石，而現有研究同時使用了脫細胞和脫礦物質過程，這導致骨的生物礦化特性被削弱。此外，本研究還提出了基于 GEL 的 mTG 交聯（一種已獲 FDA 批準的材料）簡約生物墨水配方，與使用多種改性劑或化學成分的復雜水凝膠系統相比，這種配方可以直接制備，而這些改性劑或化學成分可能會產生細胞毒性，也無法用于臨床。
文章來源：https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/ad2c98
來自土耳其伊茲密爾理工學院的Aylin Kara Özenler 團隊與來自德國埃爾朗根-紐倫堡大學的Aldo R Boccaccini團隊評估了在含有明膠（GEL）和前成骨細胞（MC3T3-E1）或人間充質干細胞（hTERT-MSCs）的生物墨水配方中加入不同大小（≤45 和 ≤100 μm）和濃度（1%、5%、10%（重量百分比））的脫細胞骨顆粒的效果。此外，本研究還提出了一種使用明膠、DB 顆粒和細胞的簡易生物墨水配方，其制備過程簡單，細胞存活率高。本研究對油墨的打印性能進行了評估。此外，還通過剪切稀化和觸變性測試確定了流變特性。生物打印結構經過 28 天的培養。使用生化分析和熒光顯微鏡評估了細胞的活力、增殖和成骨分化能力。DB 顆粒的加入增強了細胞增殖和成骨分化能力，這可能是由于 DB 顆粒含有天然膠原蛋白和羥基磷灰石。使用 DB 粒子后，堿性磷酸酶活性顯著增加，特別是在沒有誘導細胞成骨的情況下。此外，熒光圖像顯示了細胞與材料之間明顯的相互作用以及細胞在結構內部的附著。有了這些充滿希望的結果，目前的簡易生物墨水配方被認為是骨組織工程的潛在候選材料，它是一種可用于臨床的材料，制備簡單，細胞活性高。相關工作以題為“3D bioprinting of mouse pre-osteoblasts and human MSCs using bioinks consisting of gelatin and decellularized bone particles”的文章發表在2024年03月13日的國際知名期刊《Biofabrication》。
1. 創新型研究內容
本研究的目的是開發一種由凝膠、DB 顆粒和細胞組成的最小化生物墨水配方，并評估凝膠基質中不同大小和濃度的 DB 顆粒對細胞行為的影響。研究示意圖如圖 1 所示。在之前的研究中，發現 DB 粒子和 GEL 組合作為生物材料墨水對 MC3T3-E1 前成骨細胞有利。本研究用小鼠前成骨細胞（MC3T3-E1）和人端粒酶逆轉錄酶修飾的間充質干細胞（hTERT-MSCs）測試了 GEL/DB 復合生物墨水配方。在凝膠基質中加入了不同大小和濃度的 DB 粒子，以獲得可打印的配方，同時增強細胞的行為。正如本研究之前所報道的，100 微米的顆粒大小會降低較高顆粒濃度下的可打印性，因此，本研究的假設是，減小顆粒大小可能會增加可打印性，而且細胞行為也會隨著 DB 顆粒濃度的增加而增加。因此，本研究在兩種不同細胞類型的生物墨水配方中評估了不同大小的 DB 粒子的效果。通過與 mTG 交聯，3D生物打印結構的穩定性得以保持。在為期 28 天的培養過程中，對所有3D生物打印細胞負載 GEL/DB 構建物的細胞相容性、生物活性和成骨分化進行了評估。
圖1 研究示意圖
【流變特性】
本研究對 GEL 和 DB 嵌入式 GEL 生物材料油墨的流變特性進行了評估，以模擬與打印工藝相關的油墨流動條件。每組都進行了剪切稀化試驗，通過將剪切速率從 0 s-1 增加到 100 s-1 來測量粘度。圖 2A 顯示，所有生物材料油墨的粘度都隨著剪切速率的增加而降低，這表明所有材料都表現出適合擠壓式 3D 打印的剪切稀化行為。在剪切速率為 10 s-1 時，GEL 的粘度被測定為 74 Pa.s，與加入 DB 粒子的組相比，差異具有統計學意義（圖 2（B））。此外，添加不同大小和濃度的 DB 粒子也會影響粘度。經測定，GEL/1 DB（100 μm）、GEL/5 DB（100 μm）、GEL/5 DB（45 μm）和 GEL/10%DB （45 μm）的粘度分別為 91.70、111.61、123.84 和 170.67 Pa.s，在統計學上存在顯著差異（圖 2(B)）。與 100 μm 的 DB 顆粒相比，45 μm 的 DB 顆粒增加了油墨的粘度，其統計差異表明較小的顆粒尺寸增強了流變特性。值得注意的是，如圖 2（B）所示，摻入 10% DB 顆粒的油墨粘度更高。這可能是由于油墨內部顆粒之間的相互作用。當復合油墨配方中的固體顆粒之間的相互作用被剪切力破壞時，就會出現剪切變稀的行為。油墨靜止時的粘度較高，這是由懸浮顆粒之間的相互作用重新組織決定的，從而提供了形狀穩定性。因此，較小尺寸的 DB 顆粒濃度越高，懸浮顆粒之間的相互作用就越密集，從而導致粘度越高。此外，在本研究團隊之前的研究中，本研究發現較高的 DB 粒子濃度（>5%）會降低可打印性，而另一方面，高濃度的 DB 粒子有助于細胞生長。本研究發現較小尺寸的 DB 粒子在較高濃度下會增強流變特性，這也是本研究的假設之一。
圖2 油墨和 3D 打印水凝膠的流變特性及打印性能評估
【3D 打印 GEL/DB 支架】
本研究對 GEL 和 GEL/DB 油墨的可打印性進行了評估。光鏡圖像顯示了用轉谷氨酰胺酶交聯后不同大小和濃度的3D打印 GEL 和 GEL/DB 水凝膠（圖 2(D)）。水凝膠被制成圓柱形，具有交替的 0°/90°支桿結構，從而在支桿之間形成方形大孔。3D打印的 GEL 和 GEL/DB 水凝膠顯示出具有方形孔幾何形狀的良好打印結構（圖 2(D)）。所有墨水都很容易打印，特別是較小尺寸（45 微米）、較高濃度的 DB 粒子有利于打印，這可能是均勻分布在 GEL 基質中的懸浮較小 DB 粒子之間相互作用的結果。盡管純 GEL 水凝膠具有透明度，但顆粒濃度越高，GEL/DB 水凝膠的濁度越高（圖 2(D)）。所有組的打印適性因子（Pr）都是通過公式（1）計算得出的。Pr < 1 表示油墨凝膠不足，孔角呈圓形；Pr = 1 表示凝膠適當，孔幾何形狀呈理想的方形；而 Pr > 1 則表示油墨過度凝膠。所有組的 Pr 因子都接近 1。含有 5%DB 的 GEL 組顯示出較低 Pr 因子（Pr = 0.9 ± 0.04）的圓形孔幾何形狀，與純 GEL 水凝膠相比，本研究發現了統計差異（圖 2（E））。根據之前的報道，當 Pr 因子在 0.9 和 1.1 之間時，3D打印水凝膠會顯示出適當的股形態。因此，5% 的 DB 粒子（100 微米大小）會降低3D打印性能，而 5%的 DB 粒子（45 微米大小）則顯示出最佳打印性能。此外，5% 的 DB 粒子（粒徑為 45 微米）的 Pr 系數為 0.9，具有足夠的打印能力和形狀保真度。與純 GEL 組相比，將顆粒尺寸減小到 45 微米可提高 5% DB 組的可打印性，但在統計上沒有差異。
【生物打印的 MC3T3-E1 前成骨細胞負載 GEL/DB 構建物】
本研究成功制作了負載 1% GEL/DB 構建物的 MC3T3-E1 前成骨細胞，并在細胞培養期間用光學顯微鏡觀察了細胞在構建物內的分布和定位情況。圖 3 顯示了 GEL 和 GEL/DB 結構以及 TCP（組織培養聚苯乙烯）對照組內部的細胞光鏡圖像。在生物打印之前，制備了含有 MC3T3-E1 的2D鑄造 GEL 和 GEL/DB 水凝膠，以觀察水凝膠中的細胞。由于 GEL 水凝膠是完全透明的，因此不易分辨水凝膠的邊緣。如圖 3(A)所示，GEL 和 GEL/DB 水凝膠中的細胞都是可見的，7 d 后可觀察到附著和伸長的細胞（圖 3(A)）。此外，還觀察到細胞附著在 GEL/DB 水凝膠中的 DB 顆粒上（圖 3（A））。在3D生物打印樣品中，MC3T3-E1 細胞分布在 GEL 和 GEL/1% DB 構建物中，并且在細胞培養期間不斷增殖（圖 3(B)）。此外，如圖 3（C）中的放大圖片所示，14 天后，細胞遷移到結構表面，并完全覆蓋了3D生物打印結構。GEL水凝膠在 14 天后會降解，并開始在細胞培養基中失重，這在之前的報道中已有提及。由于 GEL 開始降解，細胞可以在 3D 打印的結構中找到空間并在結構中遷移。在培養期間，隨著結構的降解和細胞的增殖，細胞遷移到結構外，并在細胞培養板上觀察到細胞，如放大圖像所示（圖 3(C)）。此外，GEL 的特定 RGD 序列允許細胞在整個培養期間粘附和增殖，這證明了 GEL 和 GEL/DB 生物墨水配方的細胞相容性。
圖3 充滿細胞的2D鑄模和3D生物打印結構的光學顯微鏡圖像
在3D生物制造結構中，保持細胞活力和3D打印結構的形狀保真度或穩定性是一個重要的關鍵因素。因此，在培養期間對3D生物打印結構中的 MC3T3-E1 細胞進行活/死染色后，對其存活率進行了觀察。熒光顯微鏡圖像顯示了活細胞（綠色）、死細胞（紅色）和細胞核（藍色）（圖 4）。DB 顆粒也因其自發熒光而顯示為藍色/綠色。圖像顯示，MC3T3-E1 細胞在第 7 天時附著在 GEL 和 GEL/DB 構建物內并保持活力（圖 4(A)）。14 天后，細胞在結構中附著和擴散得更多，只觀察到少量死細胞（圖 4(A)）。培養 14 d 后，DAPI 染色顯示細胞核密集。此外，2D細胞負載 GEL 和 GEL/DB 水凝膠中的 MC3T3-E1 細胞在第 14 天仍保持活力（圖 4(B)）。活/死染色結果證實，GEL 和 GEL/DB 墨水配方具有細胞相容性，不會損害 MC3T3-E1 細胞的活力。
圖4 MC3T3-E1 細胞的活/死染色結果
在 28 天的培養期內，用 LDH 細胞毒性檢測法評估了油墨可能產生的細胞毒性效應。在2D細胞培養中，細胞釋放的細胞外 LDH 水平相似，在 28 天的培養期內沒有發現統計差異（圖 5(A)）。然而，3D生物打印組在第 1 天的 LDH 水平明顯更高（圖 5(A)）。早期 LDH 水平較高的原因可能是3D生物打印過程中剪切力導致細胞死亡。在隨后的培養天數中，細胞外 LDH 水平持續下降，并具有統計學意義，這表明剩余細胞在后期培養中存活并增殖。MC3T3-E1 細胞的存活率是根據 WST-8 法測定的細胞代謝活性進行量化的，數據顯示，在整個培養過程中，各組細胞的存活率都在逐漸增加（圖5(B)）。此外，3D生物打印 GEL 和 GEL/DB 結構的細胞存活率較高，與2D澆鑄組相比有顯著的統計學差異。此外，與其他組相比，3D生物打印 GEL/DB 結構中的細胞存活率最高（圖 5(B)）。
【細胞增殖和形態】
根據 PicoGreen 檢測法對dsDNA 的定量分析，本研究評估了生物打印結構內部的細胞增殖情況。與根據代謝活性得出的存活率結果（圖 5(B)）一致，生物打印結構內部的細胞數量在細胞培養期間逐漸增加（圖 5(C)）。第一天，生物打印結構中的細胞數量低于2D澆注水凝膠中的細胞數量，這可能是圖 5（A）所示第一天釋放的 LDH 較高的結果。第一天之后，2D澆注水凝膠組的細胞數量在第 7 天有所增加，然后在整個培養期間保持穩定。另一方面，3D生物打印結構中的細胞在 28 天內繼續增殖，與2D水凝膠相比，在第 7 天、14 天和 28 天發現了顯著的統計學差異。此外，在第 21 天，生物打印 GEL/DB 構建物中的細胞數量最多，與3D打印 GEL 組相比，差異有統計學意義（圖 5(C)）。根據細胞毒性、存活率和增殖調查，GEL 和 DB 加入 GEL 的生物墨水為生物打印后的細胞生長提供了3D微環境，作為一種基于天然的最小化生物墨水配方，顯示出良好的效果。
本研究利用熒光顯微鏡評估了3D生物打印結構和2D澆注水凝膠內的細胞粘附性和細胞形態。DAPI 和 F-Actin 染色分別顯示 MC3T3-E1 細胞的細胞核（藍色）和細胞骨架（綠色）。顯微鏡圖像顯示了2D鑄造和3D生物打印結構的細胞粘附情況，以及培養 28 天后細胞與材料的相互作用（圖 5(D)）。2D澆鑄組在第 28 天顯示了細胞與材料的相互作用，細胞覆蓋了 DB 嵌入 GEL 水凝膠內的 DB 顆粒表面（圖 5(D)）。在3D生物打印 GEL/DB 組中，細胞覆蓋了結構，顯示出與 DB 粒子非常積極的相互作用，此外，細胞在第 28 天覆蓋了孔區域，這可以從放大圖像中看到（圖 5(D)）。
圖5 細胞在 GEL 和 GEL/DB 構建物內生長
【評估不同大小和濃度的 DB 粒子對負載 hTERT-間充質干細胞的3D生物打印 GEL/DB 構建物的細胞行為的影響】
本研究對3D生物打印結構內的細胞存活率通過活/死染色進行了評估。熒光顯微鏡圖像顯示，在 28 天的培養期間，細胞在 GEL 和 GEL/DB 構建物內存活和生長（圖 6）。此外，由于膠原纖維的自發熒光，DB 顆粒顯示出藍色。第一天，在所有組中都觀察到大量存活細胞（綠色），并檢測到細胞集群，特別是在 DB 結合的結構中。由于顆粒密度高且具有自發熒光，hTERT-間充質干細胞在第一天并不清晰可見。然而，大面積的綠色染色，尤其是在 10%的 DB 組中，表明結構內形成了細胞簇（圖 6）。7 天后，細胞開始在生物打印結構中伸長和擴散，之后細胞在 28 天的培養期內保持活力并不斷增殖。hTERT 間充質干細胞的擴散良好，培養 28 d 后觀察到細胞完全覆蓋。此外，活細胞的密度在所有培養日都很高。即使在第 28 天也很難發現死細胞（紅色），這表明油墨配方具有細胞相容性，較高的 DB 粒子濃度有助于細胞生長。
圖6 3D生物打印 GEL 和 GEL/DB 復合結構中 hTERT-MSC 細胞第 14 天的活/死染色結果
生物打印后，使用 LDH 細胞毒性檢測法對墨水材料的潛在細胞毒性進行量化。將含有細胞的結構培養 28 天，在每個時間點對細胞培養上清液中的細胞外 LDH 釋放量進行量化。結果顯示，在整個培養過程中，各組的 LDH 水平都保持穩定，沒有增加。各時間點和各組之間沒有發現統計學差異，這表明含有 GEL 成分的 DB 對 hTERT-間充質干細胞沒有細胞毒性作用（圖 7(A)）。正如在 GEL 構建物中加入兔 DB 粒子（圖 4 和圖 5）所顯示的那樣，牛 DB 粒子對 hTERT-MSC 也沒有細胞毒性作用。
圖7 生物打印 GEL/DB 構建物內 hTERT-MSC 細胞的生物活性
本研究利用共聚焦顯微鏡詳細評估了3D生物打印結構內部的細胞形態和細胞附著情況。細胞核（藍色）和細胞骨架（綠色）分別采用 DAPI 和 F-Actin 染色（圖 8）。此外，由于 DB 顆粒中纖維膠原的自發熒光，結構內部的 DB 顆粒也清晰可見（呈紅色/粉紅色）。圖像顯示，細胞在第 28 天時在3D生物打印結構內部生長和增殖（圖 8）。細胞在 GEL 和 GEL/DB 構建物內附著并伸長，所有組中都能看到細胞覆蓋的趨勢。值得注意的是，在含有 10% DB 的 GEL 構建物中觀察到了更大的細胞網絡以及與 DB 顆粒的良好互動。這種細胞粘附性表明，細胞與 GEL/DB 組中均勻分布的 DB 顆粒進行了理想的相互作用。
圖8 3D生物打印 GEL 和 GEL/DB 構建物內生長的 hTERT 間充質干細胞在培養第 28 天時的共聚焦顯微鏡圖像
2. 總結與展望
本研究展示了一種由 GEL、DB 顆粒和 MC3T3-E1 前成骨細胞或 hTERT-MSCs組成的最小化生物墨水配方。本研究的主要方法是利用骨組織的天然 ECM 成分，并確定顆粒的理想濃度，以獲得更好的細胞反應。本研究中使用的 DB 顆粒不僅含有膠原纖維，還含有羥基磷灰石，而現有研究同時使用了脫細胞和脫礦物質過程，這導致骨的生物礦化特性被削弱。此外，本研究還提出了基于 GEL 的 mTG 交聯（一種已獲 FDA 批準的材料）簡約生物墨水配方，與使用多種改性劑或化學成分的復雜水凝膠系統相比，這種配方可以直接制備，而這些改性劑或化學成分可能會產生細胞毒性，也無法用于臨床。
文章來源：https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/ad2c98
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