肝移植是目前治療終末期肝衰竭最有效的方法，但由于供體肝短缺，限制了其臨床應用。近年來，生物3D打印作為一種先進的組織工程技術，為肝臟組織模型的體外構建提供了新的途徑。然而，目前大多數肝組織模型構建使用的細胞功能存在欠缺，且打印構建依賴于傳統的分散細胞打印方法——將消化后的細胞懸液混入打印材料作為生物墨水。打印后單個細胞分散在水凝膠中，存在細胞間相互作用不足、細胞功能無法長期維持等問題，限制了3D打印構建的肝組織模型的功能和體內治療效果。
 

        2025年3月，來自清華大學機械系生物制造中心的龐媛和北京大學/昌平實驗室鄧宏魁團隊在中科院1區23分Top期刊Gut上發表了題為《Bioprinting functional hepatocyte organoids derived from human chemically induced pluripotent stem cells to treat liver failure》的文章。研究人員提出了一種基于球狀體打印的策略，打印具有良好生物功能的肝細胞類器官，成功構建了高活性、功能性的肝組織模型，并在小鼠肝衰竭模型中驗證了其良好的治療效果。
讓我們一起解讀這篇文章中介紹的肝臟類器官培養技術，看看這一模型在肝臟疾病研究領域的應用前景！
研究背景
       最近的研究致力于通過結合3D生物打印和類肝細胞構建功能性肝組織。然而，維持強大的肝功能及其在體內的長期存活仍然是一大挑戰。由于原代人肝細胞（PHH）的供應有限，研究人員常使用肝癌細胞系（如HepG2、Huh-7和HepaRG）進行3D生物打印。但這些細胞系缺乏特定的肝功能，限制了其在生物打印肝組織中的應用。此外，單細胞生物打印技術整合的細胞數量有限，而細胞間相互作用的缺乏會顯著影響肝細胞的存活和生物功能，進而限制肝組織模型功能的長期維持。因此，為保證生物打印肝組織功能的長期穩定性，整合理想的細胞來源與改進的生物打印技術至關重要。
      大規模生產具備成熟功能的肝細胞是構建有效肝組織的關鍵。人誘導多能干細胞（hiPSC）能夠自我更新并分化為各種細胞類型，具有成為3D生物打印組織細胞來源的巨大潛力。然而，傳統的hiPSC生成方法通常涉及基因改造，可能影響安全性。近期，作者團隊成功利用小分子化學重編程技術（hCiPSC）生成hiPSC。這一方法無需基因改造即可生成人類多能干細胞。作者進一步建立了一種從hCiPSC生成的功能性肝細胞（hCiPSC-Hep）的方案。這些肝細胞可在體外大規模生產，并且其關鍵肝功能可與PHH相媲美，確保了生物打印肝組織具備充足且功能完善的細胞來源。
      與傳統的單細胞打印技術不同，基于球狀體的生物打印將高密度聚集的肝類器官（HO）與生物材料結合。Cuvellier等人的研究表明，借助球狀體生物打印技術，PHH球狀體在體內可維持活性并保持人類特異性肝功能長達28天。因此，球狀體生物打印可確保豐富的細胞間相互作用，使其更接近天然肝組織，有望提高肝功能的長期維持能力。
     hCiPSC衍生的HO（hCiPSC-HO）與基于球狀體的生物打印相結合，使用基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的微孔裝置進行可擴展的類器官培養，生成功能良好、細胞密度高的肝組織，用于治療肝功能衰竭。生物打印的 HO（3DP-HO）在肝功能衰竭小鼠模型中表現出卓越的治療效果，表明其在肝臟再生醫學方面具有巨大的臨床研究潛力。
研究思路
        利用氧滲透微孔板設備成功大規模制備hCiPSC-HO。收獲hCiPSC-HO并與GelMA混合，制備生物墨水用于3D生物打印3DP-HO。應用RNA-Seq、RT-qPCR、H&E染色、免疫熒光染色和TUNEL染色等技術評估3DP-Ho的形態及功能。在CCl₄誘導的急性慢性肝衰竭小鼠和Fah−/−肝衰竭小鼠模型中評估3DP-Ho的臨床應用潛力。
 

研究結果

1. 利用氧滲透微孔板設備大規模生成高功能性hCiPSC-HO
基于此前發表的實驗方案，作者成功制備了大量以hCiPSC-HPC作為HO細胞來源的hCiPSC-HO。接種2天后，hCiPSC-HPC細胞懸浮并在微孔陣列中自組織形成球狀體。該氧滲透微孔板設備可實現高存活率球狀體的大規模生成。

每個培養孔中包含約14600個分布在微孔板的圓形片層上的微孔。與由組織培養處理的聚苯乙烯制成的非氧滲透型商業培養板相比，應用這一設備生成的 hCiPSC-HPC球狀體直徑更大，并且細胞存活率顯著提高。球狀體在成熟過程中保持完整的形態，從第7天起外圍區域偶有細胞分散（圖2A）。

在最初6天內，球狀體的平均直徑穩步增長，而后續測量結果顯示其直徑分布范圍擴大，平均直徑約為95 μm（圖2B）。活-死雙重染色（圖2C）和細胞存活率分析（圖2D）表明，在前6天的培養期間，球狀體存活率始終保持在90%以上。然而，第7天起細胞存活率顯著下降，表明hCiPSC-HPC球狀體可能因過度生長而誘導細胞凋亡。
 

在微孔培養系統中，作者評估了hCiPSC-HPC球狀體和2D培養的hCiPSC-HPC的白蛋白（ALB）分泌和尿素合成情況（圖2E）。與2D細胞培養相比，hCiPSC-HPC球狀體的ALB分泌和尿素合成水平普遍更高，這表明3D細胞球培養模式有助于HO的成熟。ALB分泌和尿素合成均在第7天達到峰值，但隨后因細胞死亡逐漸下降。作者將培養7天成熟的hCiPSC-HPC球狀體定義為hCiPSC-HO，并用于進一步的表征分析和3D生物打印研究。

作者還評估了hCiPSC、hCiPSC-HPC、hCiPSC-Hep、hCiPSC-HO及PHH的肝功能相關基因表達水平（圖2F）。hCiPSC為陰性對照，PHH為陽性對照。與hCiPSC-Hep相比，hCiPSC-HO細胞中HNF4A、CYP3A4、CPS1和F5表達水平更高。不同細胞組別的ALB分泌、尿素合成及CYP3A4活性數據（圖2G）表明，hCiPSC-HO的功能水平顯著高于hCiPSC-Hep和hCiPSC-HPC。此外，hCiPSC-HO的ALB分泌和尿素合成水平與PHH相當，進一步驗證了其優越的肝功能特性。

為了進一步確認hCiPSC-HO的肝細胞功能，作者進行了吲哚氰綠（ICG）攝取與釋放實驗（圖2H）、油紅O染色、PAS染色及乙酰化低密度脂蛋白（Ac-LDL）攝取實驗（圖2I）。免疫熒光分析顯示，hCiPSC-HO細胞顯著表達基本肝功能標志物HNF4A和ALB、藥物代謝相關標志物CYP3A4和UGT1A3以及尿素循環相關標志物 CPS1（圖2J）。

以上實驗說明，氧滲透微孔板設備成功大規模生成了高存活率、高生物功能的hCiPSC-HO，有望成為3D生物打印肝組織模型的重要細胞構件。
 

2. 基于球狀體的生物打印構建肝組織模型確保了hCiPSC-HO高存活率和生物功能

作者從微孔板設備中收獲hCiPSC-HO，并將其與10%明膠甲基丙烯酸酯（GelMA）前體混合，制備生物墨水。生物打印后，hCiPSC-HO均勻分布于格子狀水凝膠結構中。在6天的培養過程中，hCiPSC-HO在水凝膠中保持球狀形態（圖3A）。

活-死雙重染色表明，在第0天，球狀體外圍區域的細胞死亡較少，但大多數球狀體由于擠出式生物打印產生的剪切應力而發生一定程度的拉長（圖3B）。盡管如此，hCiPSC-HO仍表現出持續生長，平均直徑不斷增加（圖3C）。特別是在生物打印后的前2天，球狀體的平均圓度迅速增加（圖 3D）。hCiPSC-HO的細胞存活率在生物打印后迅速恢復（圖3E）。因此，hCiPSC-HO在生物打印后能夠迅速恢復球狀形態和細胞存活率，這可能歸因于細胞在生物打印結構中的重新組織和重組。

此外，作者進一步對比了基于單細胞和基于球狀體的生物打印技術（圖3F-G）。對于基于單細胞的方法，作者使用了2D培養的hCiPSC-Hep。在水凝膠結構中分散細胞后，第0天檢測到大量細胞死亡，細胞存活率僅52.56%±6.37%，可存活細胞密度為0.74±0.11×10⁷細胞/mL。培養6天后，細胞數量進一步減少，且未觀察到明顯的球狀體形成。

相比之下，在基于球狀體的生物打印方法中，盡管第0天有部分細胞死亡，但到第6天，細胞存活率完全恢復。因此，基于球狀體的生物打印技術不僅提升了細胞存活率，還確保了肝組織模型中來源于hCiPSC的肝細胞的良好生長。這兩者生物打印后的ALB分泌和尿素合成均在第2天達到峰值（圖3H）。因此，作者將生物打印后2天的模型命名為3DP-HO，并用于進一步的表征分析和體內植入研究。
 

作者比較了hCiPSC-Hep、未生物打印的hCiPSC-HO、3DP-HO以及PHH的肝功能相關基因表達，并評估了ALB分泌和尿素合成水平（圖3I）。結果顯示：3DP-HO的HNF4A、ALB、CYP3A4、CPS1、ASS、F5和F11基因表達水平顯著高于hCiPSC-Hep。3DP-HO的ALB分泌和尿素合成高于hCiPSC-Hep，但低于未生物打印的hCiPSC-HO。

hCiPSC-HO和3DP-HO的CYP3A4活性無顯著差異，但均遠高于hCiPSC-Hep（圖3J）。這種差異可能與GelMA 水凝膠的吸收及生物打印后細胞功能恢復不完全有關。免疫熒光分析證實3DP-HO高表達HNF4A、ALB、CYP3A4、CPS1和UGT1A3（圖3K）。因此，基于球狀體的生物打印方法能夠有效維持hCiPSC-HO的高存活率和生物功能，展現出治療肝衰竭的植入潛力。
 

3. hCiPSC-HO和3DP-HO的基因表達譜相似，并通過RNA-Seq分析展現出增強的肝功能

為了比較hCiPSC-HPC、hCiPSC-Hep、hCiPSC-HO、3DP-HO和PHH之間的基因表達特征，研究進行了高通量RNA-Seq分析。主成分分析（圖4A）和層次聚類分析（圖4B）顯示，hCiPSC-HO與3DP-HO的基因表達譜相似，表明生物打印對hCiPSC-HO的基因表達沒有顯著影響。hCiPSC-HO與PHH之間以及3DP-HO與PHH之間的基因表達差異較小，相較而言，hCiPSC-Hep與PHH之間的基因表達差異更大（圖4A）。因此，與hCiPSC-Hep相比，hCiPSC-HO和3DP-HO的表型更接近PHH。

韋恩圖分析顯示，與hCiPSC-HPC相比，hCiPSC-Hep和hCiPSC-HO中有332個共同上調的基因（圖4C）。與hCiPSC-Hep相比，hCiPSC-HO中尿素循環相關基因、細胞外基質基因、轉錄因子和細胞能量代謝基因均上調。相反，hCiPSC-HO中肝祖細胞基因以及與炎癥和凋亡相關的基因下調（圖4D）。

GO和KEGG分析表明，與hCiPSC-Hep相比，hCiPSC-HO的基因表達水平更高，涉及脂肪酸、氨基酸、酒精和藥物代謝等肝功能相關過程（圖4E-F）。hCiPSC-HO和3DP-HO的主要基因表達模式高于hCiPSC-Hep和hCiPSC-HPC（圖4G）。進一步的熱圖分析（圖4H）表明，與hCiPSC-Hep相比，hCiPSC-HO和3DP-HO的轉錄因子、分泌蛋白和藥物代謝基因水平更高。

基因集富集分析強調了hCiPSC-HO在氨基酸、分解代謝和脂肪消化/吸收過程中的優勢（圖4I）。值得注意的是，hCiPSC-HO中PPAR通路上調，該通路通常與肝細胞發育相關。總體而言，生物打印過程對hCiPSC-HO的基因表達譜影響較小；無論生物打印前后，hCiPSC-HO在肝臟生物合成和代謝功能相關基因表達方面均優于hCiPSC-Hep。
 

4. 3DP-HO移植可改善CCl₄誘導的急性慢性肝衰竭小鼠

作者將3DP-HO移植至CCl₄誘導的急性慢性肝衰竭（ACLF）小鼠體內（圖5A）。治療7天后，相較于接受無細胞生物打印結構或未接受移植小鼠，接受3DP-HO移植的小鼠生存率顯著提高（85.7%）。

為了驗證3DP-HO的治療效果是否為細胞特異性，作者移植了來源于肺癌細胞系的3D生物打印A549球狀體（3DP-A549）。結果顯示，所有3DP-A549組小鼠均在7天內死亡，證明3DP-HO的治療效果具有特異性。3DP-HO移植組與正常對照組之間無顯著差異，表明其對ACLF小鼠的生存率改善效果極為顯著（圖5B）。作者檢測到小鼠體內人源ALB的表達水平，第1天為26 μg/mL，第7天升至32 μg/mL（圖5C），明顯高于既往PHH移植研究中的報道。這些結果表明，3DP-HO移植后能夠提供有效的肝功能支持。

同時，作者監測了血清肝損傷標志物，結果顯示，Sham組、Blank組和3DP-A549組的這些標志物水平顯著升高，表明肝損傷嚴重。相比之下，3DP-HO治療顯著減輕了肝損傷，且治療7天后各指標恢復至正常組水平（圖5D）。
 

H&E染色顯示，3DP-HO移植組在第4天肝組織壞死和充血面積明顯減少（圖5E）。TUNEL染色結果表明，與Sham組、Blank組和3DP-A549組相比，3DP-HO組的凋亡細胞數量明顯減少。此外，Masson、α-SMA、Sirius Red和Collagen I染色結果顯示，3DP-HO組的長期炎癥誘導的肝纖維化明顯緩解。不同小鼠組別的肝臟組織中肝相關基因的表達情況如圖5F所示。與Sham組相比，3DP-HO組的炎癥和纖維化相關基因顯著下調。3DP-HO組與正常對照組之間無顯著差異。此外，3DP-HO治療顯著上調了肝功能相關基因Alb、Aat、Cyp2e1和Glu。以上結果表明，3DP-HO在ACLF小鼠模型中表現出良好的治療效果，包括顯著提高生存率、上調肝功能相關基因表達、減輕肝臟炎癥和纖維化。
 

5. 3DP-HO移植拯救Fah−/−肝衰竭小鼠

作者將3DP-HO移植到患有肝衰竭的Fah−/−小鼠體內，該模型模擬了人類酪氨酸血癥 I 型。如圖6A所示，小鼠飲用含硝替酮（NTBC）的水以維持正常肝臟代謝功能，而未飲用NTBC的小鼠則出現肝衰竭。Fah−/−肝衰竭小鼠分別接受了無細胞生物打印結構、3DP-A549及3DP-HO移植，并觀察60天。3DP-HO組的小鼠存活率顯著提高并且體重得以維持（圖6B-C）。60天后，Sham、Blank和3DP-A549組無一存活，而3DP-HO組的生存率達80.0%（圖6B）。

此外，3DP-HO組小鼠的體重在前三周保持穩定，隨后逐漸增加，并接近正常小鼠水平（圖6C）。人ALB的檢測結果表明，移植后第30天和第60天，小鼠血清中均檢測到人ALB，顯示3DP-HO在體內提供了穩定的肝功能。此外，ALB的分泌水平隨著時間延長而增加，表明3DP-HO中的肝細胞可能具有增殖能力，或其ALB分泌能力在體內微環境適應后得到顯著增強（圖6D）。

3DP-HO組的大多數肝損傷血清指標均顯著低于Sham、Blank和3DP-A549組（圖6E）。H&E染色顯示，接受3DP-HO治療的Fah−/−小鼠肝組織壞死和充血區域明顯減少。在3DP-HO組中，肝細胞增殖增強，而凋亡減少（圖6F）。與Sham組相比，3DP-HO組小鼠肝組織的炎癥和纖維化相關基因表達顯著降低。其中，Pten、p16、Trp53和Mmp1的表達水平接近Normal組，未觀察到統計學上的顯著差異。

此外，3DP-HO組的肝功能相關基因及細胞增殖相關基因Mki67的表達水平明顯上調。其中，Alb、Cyp2e1和Mki67的表達水平與Normal組相當，未觀察到統計學上的顯著差異（圖6G）。與Sham組相比，3DP-HO治療的Fah−/−小鼠血清中促炎細胞因子的水平顯著降低。而與Normal 組相比，3DP-HO組小鼠的IL-1β、IL-6 和TNF-α仍顯著升高，表明3DP-HO移植后肝組織中仍存在一定程度的殘余炎癥（圖6H）。

以上結果表明，長期3DP-HO治療可通過促進肝細胞增殖和功能恢復，同時減輕肝臟炎癥和纖維化，顯著提高Fah−/−肝衰竭小鼠的生存率。3DP-HO-C1、3DP-HO-C2和3DP-HO-C19在CCl4誘導的肝衰竭和Fah−/−肝衰竭小鼠模型中均表現出良好的治療效果。這些結果進一步強調了3DP-HO可來源于不同細胞，其在體內治療應用中具有廣泛潛力。
 

6. 3DP-HO在治療Fah−/−肝衰竭小鼠過程中促進血管化并維持高水平的細胞生物功能

在Fah−/−小鼠體內植入60天后,處死3DP-HO組存活的小鼠，取出腹腔內的生物打印結構。3DP-HO仍保持良好的整合狀態，呈現清晰的晶格狀結構，無明顯降解或分離（圖7A），表明GelMA水凝膠在體內具有優異的穩定性。此外，活-死雙重染色顯示，3DP-HO殘存細胞的存活率較高。然而，部分HO在水凝膠基質中解聚，并遷移至水凝膠微纖維的外圍，可能是由于這些區域氧氣和營養供應的改善（圖7B）。

在3DP-HO水凝膠結構中觀察到了毛細血管，表明移植過程中存在一定程度的組織血管化（圖7C）。FITC-Dextran和CD31免疫熒光染色證實了3DP-HO中可灌注且功能正常的新生血管存在。ALB和CD31的雙重染色顯示，毛細血管與3DP-HO之間存在密切的相互作用。推測這些毛細血管促進了氧氣和營養物質的供應。肝功能相關標志物持續表達，同時細胞連接標志物在3DP-HO內部廣泛表達并保持良好整合（圖7D-E）。與植入前相比，植入后3DP-HO在生物合成、藥物代謝和凝血相關的大多數基因表達方面未顯示出顯著差異（圖7F）。

這些研究結果強調了3DP-HO在長期植入治療過程中表現出的卓越穩定性、高細胞存活率、血管化能力和功能性,進一步表明其在治療肝衰竭方面的巨大臨床轉化潛力。

小結
      在本研究中，為了生成大規模、高活力的hCiPSC-HO，作者將hCiPSC-HPC培養在基于PDMS的透氧微孔裝置中，增強了氧氣供應。然后整合了基于球狀體的生物打印技術，使用hCiPSC-HO（3DP-HO）作為高級構建塊，實現更高密度的細胞打印。這一肝組織模型在體外和體內均表現出強大的肝功能，為終末期肝病的臨床研究奠定了基礎。
參考文獻
Li G, He J, Shi J, et al. Bioprinting functional hepatocyte organoids derived from human chemically induced pluripotent stem cells to treat liver failure. Gut. Published online March 3, 2025. doi:10.1136/gutjnl-2024-333885

(責任編輯：admin)

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