顱骨缺損，尤其是關鍵尺寸的顱骨缺損，因其自身再生能力有限，存在愈合時間長、再生不完全及骨不連風險高等問題。當前臨床修復手段如金屬植入物、同種異體移植物和人工移植物等，面臨供體有限、存在疾病傳播風險及修復效果不理想等挑戰。傳統骨組織工程的“自上而下”方法（細胞接種于生物材料支架）存在細胞分布不均、營養擴散不足、支架降解困難等缺陷，且難以復制骨骼復雜結構，同時干細胞聚集體體外成骨誘導時間長、血管化不足，限制了快速原位成骨。  
      為解決上述問題，清華大學熊卓、方永聰課題組與北京協和醫學院楊斌課題組合作，提出一種新型發育工程策略，將間充質干細胞（MSCs）、人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）與成骨微顆粒結合，大規模構建具有自組織血管化和成骨特性的預血管化骨類器官。團隊系統篩選出石墨烯氧化物（GO）作為最優成骨微顆粒，其通過粘著斑和PI3K/Akt通路顯著促進成骨分化。進一步將類器官負載于明膠甲基丙烯酰酯（GelMA）水凝膠中進行3D生物打印，構建具有高細胞密度和成骨能力的復雜組織構建體。體內實驗證實，該方法可促進快速血管化骨組織形成，實現顱骨缺損的有效原位再生修復。  
       相關工作以“3D Bioprinting of Prevascularized Bone Organoids for Rapid In Situ Cranial Bone Reconstruction”為題發表在《Advanced Healthcare Materials》上。北京協和醫學院2022級整形外科博士生段婧為第一作者，清華大學熊卓教授、方永聰助理教授及協和醫學院楊斌教授為共同通訊作者。
 

1. 研究設計與實驗流程示意圖。通過示意圖展示研究整體設計及實驗流程，研究對象為預血管化骨類器官的構建及其在顱骨修復中的應用。結果表明，結合間充質干細胞、內皮細胞與成骨微顆粒（如石墨烯氧化物）的預血管化骨類器官，經3D生物打印后可促進原位血管化骨再生，為顱骨缺損修復提供新策略。      
 

2. 預血管化成骨聚集體的表征與優化。采用強制聚集技術制備含不同成骨微顆粒（羥基磷灰石、生物玻璃、石墨烯氧化物等）的細胞聚集體，通過實時定量PCR、免疫熒光染色等方法評估成骨基因表達與細胞活性。結果表明，石墨烯氧化物（GO）組的成骨相關基因（如ALP、COL-1、Runx-2）表達顯著高于其他組，且細胞相容性良好，證實GO對成骨分化的促進作用最優。      
 

3. 負載GO的預血管化骨類器官的成骨與血管化評估。利用堿性磷酸酶染色、茜素紅染色及血管生成實驗，研究GO負載的預血管化骨類器官的成骨礦化能力與血管網絡形成。結果表明，GO促進鈣沉積與成骨分化，且含內皮細胞的聚集體可自組織形成毛細血管樣結構，CD31表達證實血管化能力，說明該類器官兼具成骨與血管化特性。      
 

4. GO促進成骨分化的分子機制轉錄組分析。通過mRNA測序與生物信息學分析，研究GO影響成骨的分子通路。結果顯示，GO組差異表達基因富集于粘著斑、PI3K/Akt信號通路等，Western blot驗證PI3K、AKT等蛋白表達上調，證實GO通過激活粘著斑和PI3K/Akt通路促進成骨分化與細胞外基質合成。      
 

5. 預血管化骨類器官的3D生物打印工藝與性能。選用7.5 wt.% GelMA水凝膠作為生物墨水載體，通過流變學測試優化打印參數，結合活/死染色評估細胞 viability。結果表明，打印結構具有良好的擠出穩定性與細胞活性（ viability ≈85.63%），且內皮細胞可形成血管網絡，證實3D打印技術可實現類器官的規模化構建與功能保留。      
 

6. 顱骨缺損修復的體內效果評估。在大鼠顱骨缺損模型中植入不同處理的生物打印 construct，通過顯微CT、組織學染色（H&E、Masson三色）及免疫熒光染色評估骨再生與血管化。結果表明，含GO與內皮細胞的預血管化骨類器官組（M+H+GO）新骨覆蓋率、骨體積分數（BV/TV=32.28±4.48%）及血管密度顯著高于其他組，且促進M2型巨噬細胞極化，證實其高效的原位骨再生與抗炎能力。      

7. 血管化與免疫響應評估。利用磁共振成像（MRI）與免疫熒光染色，分析缺損區域的血管網絡形成與巨噬細胞極化。結果顯示，預血管化組（M+H、M+H+GO）血管體積顯著大于對照組，且GO負載組CD163+（M2型）巨噬細胞比例升高，表明預血管化骨類器官通過增強血管化與免疫調節促進骨再生。      
 

研究結論
      本研究提出一種結合預血管化骨類器官與3D生物打印的新策略，用于快速原位顱骨再生。通過將間充質干細胞、內皮細胞與成骨微顆粒（如石墨烯氧化物）整合，構建了具有自組織血管化能力和增強成骨特性的類器官。3D生物打印技術將類器官負載于水凝膠中，形成定制化的大型骨移植物，實現了接近生理細胞密度的血管化骨組織構建。體內實驗顯示，該方法通過激活粘著斑和PI3K/Akt通路促進成骨分化，并通過內皮細胞自組裝形成血管網絡，顯著加速顱骨缺損的原位骨形成，同時誘導抗炎性M2巨噬細胞極化。研究結果表明，這種發育工程策略克服了傳統支架方法的局限性，為骨再生提供了可擴展的有效途徑，有望推動生物制造和組織工程在臨床再生治療中的應用。


文章來源：
https://advanced.onlinelibrary.w ... 1002/adhm.202501376

(責任編輯：admin)

• 3D打印技術突破：生物工程
• 仿生3D打印實現＂軟硬通吃
• 重慶大學-同濟大學-北京大
• 微米級3D打印促進建筑模型
• 預血管化骨類器官的3D生物
• 極坐標線投影光固化連續3D

• ·3D打印技術突破：生物工程胰島保持形狀
• ·仿生3D打印實現＂軟硬通吃＂ - UT-Aust
• ·重慶大學-同濟大學-北京大學-增材制造
• ·微米級3D打印促進建筑模型精細化集成化
• ·預血管化骨類器官的3D生物打印用于快速
• ·極坐標線投影光固化連續3D打印：實現管
• · 3D打印的500年前假肢手復制品暗示了文
• ·Lithoz的LCM陶瓷3D打印如何解決半導體