三維打印在軟骨組織工程中的應用
時間：2024-03-14 09:14 來源：南極熊 作者：于淑穎 李昱 程新好 閱讀：次
作者：于淑穎 李昱 程新好 張怡君 劉錚 閆成祥 謝百慧 王喜梅
來源：《中華整形外科雜志》2024年01月 第40卷 第01期
作者單位：鄭州大學第一附屬醫院整形外科， 鄭州450000
通信作者：王喜梅，Email:tracywang@zzu.edu.cn
在過去的幾十年中，軟骨的再生已經取得了巨大的進展。傳統構建組織工程軟骨支架的技術主要包括孔劑法(或模板法)、相分離法、氣體發泡法、冷凍干燥法、靜電紡絲法等。軟骨是異質性的，傳統支架很難模擬軟骨的高度各向異性結構。因此，軟骨的功能再生具有挑戰性。隨著三維打印技術的進步，通過生物材料、細胞和活性生物分子的共沉積，使制備精細結構、梯度變化的功能性仿生支架成為可能，從而實現功能性軟骨再生。該文詳細闡述了三維打印技術及其在不同解剖位置(關節、耳廓、鼻)軟骨再生中的應用。此外，還討論了制備具有區域結構梯度和區域成分梯度的仿生構建體的重要性。三維生物打印、四維打印技術及智能材料為仿生組織和器官的構建帶來了希望。
軟骨組織工程是集材料學、細胞生物學、工程學等多學科的研究領域，隨著材料科學、細胞生物學以及三維打印技術等的不斷進步，近幾十年來軟骨組織工程也得到了飛速的發展 [ 1 ]。軟骨組織工程包括支架、種子細胞和生長因子3個經典要素 [ 2 ]，該技術主要是利用自體軟骨細胞或成體干細胞作為種子細胞，將種子細胞接種在具有三維多孔結構的生物可降解支架材料上，種子細胞在生長因子的指導作用下，經過適當的分化調節，形成軟骨或軟骨樣組織 [ 3 ]。軟骨支架為種子細胞的擴散和增殖提供支撐作用，也為軟骨及軟骨樣組織的再生和重建提供有利空間，在軟骨組織工程中占據至關重要的位置。理想的軟骨組織工程支架材料應具有以下幾個特性：(1)生物相容性，支持種植于其上的種子細胞增殖、分化、成熟；(2)可降解性，支架置入后隨著時間的推移可以緩慢降解，并促進細胞產生新的軟骨基質取代支架材料，以便再生軟骨組織將其取代 [ 4 ]；(3)生物力學性能，能穩定維持軟骨的形狀，具有與要修復軟骨組織一致的機械性能；(4)個性化，支架的外形應當與修復區域匹配，或易于被塑造成各種所需的形狀；(5)適當的孔隙率，允許分子、營養物和氧氣的遷移和擴散 [ 5 ]。
傳統的軟骨支架制備方法包括孔劑法(或模板法)、相分離法、氣體發泡法、冷凍干燥法、靜電紡絲法等，具有簡便、經濟等優點，但是也存在著難以靈活設計和精確調控支架的微觀結構、難以個性化制造與損傷部位高度契合的支架外形、難以構建非均勻特征的支架(雙相及多相支架)等缺點。近年來，三維打印技術發展迅速，在計算機輔助成型的基礎上能夠精準構建和調控支架的宏觀外形與微觀特征，形成具有良好相容性、形態和力學強度適宜的軟骨仿生梯度支架，最終達成軟骨及軟骨樣組織的個性化修復與再生 [ 6 , 7 ]。因此，三維打印技術在軟骨組織工程領域中的應用有著廣闊的發展前景。本文詳細介紹了軟骨組織工程的種子細胞、支架材料、三維打印技術，以及三維打印技術在不同解剖位置(關節軟骨、耳廓、鼻)軟骨再生中的應用。此外，還討論了具有區域結構梯度和區域成分梯度的仿生構建體的制備方法，三維生物打印技術、四維打印、智能材料為仿生組織和器官的構建帶來了希望。
一、三維打印技術
(一)三維打印技術的幾種方式
三維打印技術是一種快速成型技術，又稱增材制造，是以數字模型文件為基礎，運用粉末狀金屬或塑料等可粘合材料，通過逐層打印的方式來構造物體的技術 [ 1 ]。通過結合CT、MRI、表面掃描和三維攝影等成像技術，利用計算機輔助設計(computer-aided design，CAD)和計算機輔助制造(computer-aided manufacturing，CAM)技術，將目標軟骨形狀數據轉化為三維打印數字模型文件，再經由三維打印技術精確定制軟骨結構外形，獲得理想的組織工程軟骨。常見的三維打印方式包括：熔融沉積技術(fused deposition modeling, FDM)、立體光刻法、低溫沉積制造(low-temperature deposition modeling, LDM)、選擇性激光燒結(selective laser sintering, SLS)、三維打印成型(three-dimensional printing, 3DP)、電子束自由成型制造(electron beam freeform fabrication, EBF)、直接金屬激光燒結(direct metal laser sintering, DMLS)、電子束熔化成型(electron beam melting, EBM)、選擇性激光熔化成型( selective laser melting, SLM)、選擇性熱燒結(selective heat sintering, SHS)等 [ 8 , 9 ]。下面主要介紹FDM、立體光刻法、LDM及SLS。
1．FDM
FDM是最常用的三維打印技術。FDM原理是在計算機精準控制路徑中，高溫熔融擠出聚合物材料流經噴嘴后，材料在逐層打印過程中形成適當的形狀( 圖1 )。FDM可以快速制造具有高度互連的孔幾何結構和通道尺寸的支架。通過改變擠出壓力、噴嘴直徑和沉積速度等工藝參數，可以打印具有寬范圍細絲直徑和孔隙率的支架。FDM通常適用于聚己內酯(polycaprolactone, PCL)、聚乳酸、聚乳酸-羥基乙酸等熱塑性高分子的成型以及少數溫敏材料的打印，其特點是材料加工應用靈活，打印的結構精度高、支架力學強度較為理想，可構建多種軟骨支架，在三維打印中廣泛應用。但由于FDM加工溫度高，FDM的材料處于受熱狀態，細胞無法在打印過程存活，不適用于生物打印 [ 8 ]。
2．立體光刻法
立體光刻法包括光固化(stereolithography, SLA)和數字光處理(digital light processing，DLP) 技術，是感光性材料經光源照射后迅速發生固化，逐層沉積，最終實現三維打印成型。立體光刻法不是基于噴嘴方式，而是液體材料位于樹脂浴中，其中構建板降低并且光源跟蹤編程圖案僅交聯設計的部分，該過程可逐層讓材料沉積，直到物體成型完成 [ 10 ]，它避免了在其他技術中通常觀察到的細胞上的剪切應力。SLA和DLP技術間的區別是使用的光源不同，SLA使用激光，而DLP使用來自投影的光源。激光系統逐點誘導光敏材料的選擇性交聯，而DLP系統使用動態反射鏡陣列，選擇性地將光投射到區域中，以交叉鏈接分配給每個層的所有點 [ 11 ]。SLA或DLP基于光敏聚合物原料，可以獲得較高的結構精度和穩定性，并且SLA立體成型成熟度最高，成型速度快，尺寸精度高，適用于光敏水凝膠(如雙鍵改性的明膠和透明質酸)構建軟骨支架和生物打印。常用的感光性水凝膠材料如甲基丙烯酸化的藻酸鹽、明膠、聚乙二醇等可用于軟骨組織工程構建 [ 12 ]。
3．LDM
LDM在受控的冷卻室的作用下，使復合漿料或溶液在沉積過程中始終保持低溫狀態 [ 13 ]。LDM適用于高分子漿料、混合生物材料和聚合物的打印，可實現高精度復合漿料沉積，并且可以通過冷凍干燥在材料表面形成微孔，但是LDM可能會在構建體中殘留有機溶劑 [ 9 ]。
4．SLS
SLS是一種在計算機控制下進行激光掃描，以在工作平臺上熔化和粘結粉末材料的技術。當一層掃描完成后，在固化層的表面涂上一層新的粉末材料，對其進行掃描并逐層粘合，以產生三維結構。SLS主要適用于金屬粉末、塑料和陶瓷的打印。SLS無需使用支撐材料，加工速度快，但是持續高溫可能會導致聚合物材料降解，產品表面粗糙且需要后處理，加工過程中會產生灰塵和有毒氣體。因此，SLS不適用于水凝膠成型 [ 9 ]。
(二)三維生物打印
三維生物打印是眾多三維打印技術中的一個分支，也是組織工程和再生醫學的一種先進輔助技術手段 [ 14 , 15 ]。目前三維打印技術廣泛應用于軟骨支架的打印，由于材料特性以及成型條件限制，需要在軟骨支架打印成型后接種種子細胞。而三維生物打印以活體細胞與支架材料為生物墨水進行同步打印，最終形成具有生理功能的組織或器官。傳統三維打印技術無法精準調控接種在軟骨支架上種子細胞的空間分布，所構建的微環境與體內差異大。三維生物打印彌補了傳統三維打印的缺點，精細控制細胞分布以及機械、化學性質的調節，可以更好地模擬天然軟骨的解剖結構及其生理功能 [ 9 , 16 ]。這開辟了許多新的視角，包括通過開發復雜結構(如骨軟骨隔室)、不同類型的軟骨(透明軟骨、纖維軟骨、彈性軟骨)和根據特定患者的需要，構建個性化醫療。三維生物打印的關鍵要素在于生物墨水的設計，傳統三維打印軟骨支架時，由于沒有活體細胞的存在，可選擇的打印方式較多，打印條件可較為苛刻，如冷凍、加熱、高強度光交聯等；傳統三維打印可選擇的打印墨水較為寬泛，如水凝膠的水相溶液、熱塑性高分子的有機溶液或熔融漿料；傳統三維打印可控制的打印墨水的參數自由度較大，可最大限度提高支架材料的濃度和黏度以獲取更加理想的結構成型效果。而三維生物打印由于生物墨水中活細胞的存在，為保持細胞的生物活性，可選擇的打印方式較少，生物墨水的制備和打印也需避免苛刻的環境；由于水凝膠十分接近天然細胞外基質(extracellular matrix, ECM),細胞可以在水凝膠內部存活，因此水凝膠是目前制備生物墨水的最主要材料 [ 17 , 18 ]。三維生物打印成型性能(與結構相關)和細胞活性(與功能相關)對于生物墨水的特性(如黏度、強度等)有著相反的要求，前者希望生物墨水有較高的濃度、交聯密度等，后者正好相反。由于單種水凝膠存在各自的缺陷，復合生物墨水體系已成為軟骨生物打印的主流。目前，三維生物打印技術還處于發展階段，適宜的生物墨水較少是限制其發展的重要原因之一，開發更多可供選擇的生物墨水是目前三維生物打印技術重要的研究方向 [ 19 , 20 ]。
來源：《中華整形外科雜志》2024年01月 第40卷 第01期
作者單位：鄭州大學第一附屬醫院整形外科， 鄭州450000
通信作者：王喜梅，Email:tracywang@zzu.edu.cn
在過去的幾十年中，軟骨的再生已經取得了巨大的進展。傳統構建組織工程軟骨支架的技術主要包括孔劑法(或模板法)、相分離法、氣體發泡法、冷凍干燥法、靜電紡絲法等。軟骨是異質性的，傳統支架很難模擬軟骨的高度各向異性結構。因此，軟骨的功能再生具有挑戰性。隨著三維打印技術的進步，通過生物材料、細胞和活性生物分子的共沉積，使制備精細結構、梯度變化的功能性仿生支架成為可能，從而實現功能性軟骨再生。該文詳細闡述了三維打印技術及其在不同解剖位置(關節、耳廓、鼻)軟骨再生中的應用。此外，還討論了制備具有區域結構梯度和區域成分梯度的仿生構建體的重要性。三維生物打印、四維打印技術及智能材料為仿生組織和器官的構建帶來了希望。
軟骨組織工程是集材料學、細胞生物學、工程學等多學科的研究領域，隨著材料科學、細胞生物學以及三維打印技術等的不斷進步，近幾十年來軟骨組織工程也得到了飛速的發展 [ 1 ]。軟骨組織工程包括支架、種子細胞和生長因子3個經典要素 [ 2 ]，該技術主要是利用自體軟骨細胞或成體干細胞作為種子細胞，將種子細胞接種在具有三維多孔結構的生物可降解支架材料上，種子細胞在生長因子的指導作用下，經過適當的分化調節，形成軟骨或軟骨樣組織 [ 3 ]。軟骨支架為種子細胞的擴散和增殖提供支撐作用，也為軟骨及軟骨樣組織的再生和重建提供有利空間，在軟骨組織工程中占據至關重要的位置。理想的軟骨組織工程支架材料應具有以下幾個特性：(1)生物相容性，支持種植于其上的種子細胞增殖、分化、成熟；(2)可降解性，支架置入后隨著時間的推移可以緩慢降解，并促進細胞產生新的軟骨基質取代支架材料，以便再生軟骨組織將其取代 [ 4 ]；(3)生物力學性能，能穩定維持軟骨的形狀，具有與要修復軟骨組織一致的機械性能；(4)個性化，支架的外形應當與修復區域匹配，或易于被塑造成各種所需的形狀；(5)適當的孔隙率，允許分子、營養物和氧氣的遷移和擴散 [ 5 ]。
傳統的軟骨支架制備方法包括孔劑法(或模板法)、相分離法、氣體發泡法、冷凍干燥法、靜電紡絲法等，具有簡便、經濟等優點，但是也存在著難以靈活設計和精確調控支架的微觀結構、難以個性化制造與損傷部位高度契合的支架外形、難以構建非均勻特征的支架(雙相及多相支架)等缺點。近年來，三維打印技術發展迅速，在計算機輔助成型的基礎上能夠精準構建和調控支架的宏觀外形與微觀特征，形成具有良好相容性、形態和力學強度適宜的軟骨仿生梯度支架，最終達成軟骨及軟骨樣組織的個性化修復與再生 [ 6 , 7 ]。因此，三維打印技術在軟骨組織工程領域中的應用有著廣闊的發展前景。本文詳細介紹了軟骨組織工程的種子細胞、支架材料、三維打印技術，以及三維打印技術在不同解剖位置(關節軟骨、耳廓、鼻)軟骨再生中的應用。此外，還討論了具有區域結構梯度和區域成分梯度的仿生構建體的制備方法，三維生物打印技術、四維打印、智能材料為仿生組織和器官的構建帶來了希望。
一、三維打印技術
(一)三維打印技術的幾種方式
三維打印技術是一種快速成型技術，又稱增材制造，是以數字模型文件為基礎，運用粉末狀金屬或塑料等可粘合材料，通過逐層打印的方式來構造物體的技術 [ 1 ]。通過結合CT、MRI、表面掃描和三維攝影等成像技術，利用計算機輔助設計(computer-aided design，CAD)和計算機輔助制造(computer-aided manufacturing，CAM)技術，將目標軟骨形狀數據轉化為三維打印數字模型文件，再經由三維打印技術精確定制軟骨結構外形，獲得理想的組織工程軟骨。常見的三維打印方式包括：熔融沉積技術(fused deposition modeling, FDM)、立體光刻法、低溫沉積制造(low-temperature deposition modeling, LDM)、選擇性激光燒結(selective laser sintering, SLS)、三維打印成型(three-dimensional printing, 3DP)、電子束自由成型制造(electron beam freeform fabrication, EBF)、直接金屬激光燒結(direct metal laser sintering, DMLS)、電子束熔化成型(electron beam melting, EBM)、選擇性激光熔化成型( selective laser melting, SLM)、選擇性熱燒結(selective heat sintering, SHS)等 [ 8 , 9 ]。下面主要介紹FDM、立體光刻法、LDM及SLS。
1．FDM
FDM是最常用的三維打印技術。FDM原理是在計算機精準控制路徑中，高溫熔融擠出聚合物材料流經噴嘴后，材料在逐層打印過程中形成適當的形狀( 圖1 )。FDM可以快速制造具有高度互連的孔幾何結構和通道尺寸的支架。通過改變擠出壓力、噴嘴直徑和沉積速度等工藝參數，可以打印具有寬范圍細絲直徑和孔隙率的支架。FDM通常適用于聚己內酯(polycaprolactone, PCL)、聚乳酸、聚乳酸-羥基乙酸等熱塑性高分子的成型以及少數溫敏材料的打印，其特點是材料加工應用靈活，打印的結構精度高、支架力學強度較為理想，可構建多種軟骨支架，在三維打印中廣泛應用。但由于FDM加工溫度高，FDM的材料處于受熱狀態，細胞無法在打印過程存活，不適用于生物打印 [ 8 ]。
立體光刻法包括光固化(stereolithography, SLA)和數字光處理(digital light processing，DLP) 技術，是感光性材料經光源照射后迅速發生固化，逐層沉積，最終實現三維打印成型。立體光刻法不是基于噴嘴方式，而是液體材料位于樹脂浴中，其中構建板降低并且光源跟蹤編程圖案僅交聯設計的部分，該過程可逐層讓材料沉積，直到物體成型完成 [ 10 ]，它避免了在其他技術中通常觀察到的細胞上的剪切應力。SLA和DLP技術間的區別是使用的光源不同，SLA使用激光，而DLP使用來自投影的光源。激光系統逐點誘導光敏材料的選擇性交聯，而DLP系統使用動態反射鏡陣列，選擇性地將光投射到區域中，以交叉鏈接分配給每個層的所有點 [ 11 ]。SLA或DLP基于光敏聚合物原料，可以獲得較高的結構精度和穩定性，并且SLA立體成型成熟度最高，成型速度快，尺寸精度高，適用于光敏水凝膠(如雙鍵改性的明膠和透明質酸)構建軟骨支架和生物打印。常用的感光性水凝膠材料如甲基丙烯酸化的藻酸鹽、明膠、聚乙二醇等可用于軟骨組織工程構建 [ 12 ]。
3．LDM
LDM在受控的冷卻室的作用下，使復合漿料或溶液在沉積過程中始終保持低溫狀態 [ 13 ]。LDM適用于高分子漿料、混合生物材料和聚合物的打印，可實現高精度復合漿料沉積，并且可以通過冷凍干燥在材料表面形成微孔，但是LDM可能會在構建體中殘留有機溶劑 [ 9 ]。
4．SLS
SLS是一種在計算機控制下進行激光掃描，以在工作平臺上熔化和粘結粉末材料的技術。當一層掃描完成后，在固化層的表面涂上一層新的粉末材料，對其進行掃描并逐層粘合，以產生三維結構。SLS主要適用于金屬粉末、塑料和陶瓷的打印。SLS無需使用支撐材料，加工速度快，但是持續高溫可能會導致聚合物材料降解，產品表面粗糙且需要后處理，加工過程中會產生灰塵和有毒氣體。因此，SLS不適用于水凝膠成型 [ 9 ]。
(二)三維生物打印
三維生物打印是眾多三維打印技術中的一個分支，也是組織工程和再生醫學的一種先進輔助技術手段 [ 14 , 15 ]。目前三維打印技術廣泛應用于軟骨支架的打印，由于材料特性以及成型條件限制，需要在軟骨支架打印成型后接種種子細胞。而三維生物打印以活體細胞與支架材料為生物墨水進行同步打印，最終形成具有生理功能的組織或器官。傳統三維打印技術無法精準調控接種在軟骨支架上種子細胞的空間分布，所構建的微環境與體內差異大。三維生物打印彌補了傳統三維打印的缺點，精細控制細胞分布以及機械、化學性質的調節，可以更好地模擬天然軟骨的解剖結構及其生理功能 [ 9 , 16 ]。這開辟了許多新的視角，包括通過開發復雜結構(如骨軟骨隔室)、不同類型的軟骨(透明軟骨、纖維軟骨、彈性軟骨)和根據特定患者的需要，構建個性化醫療。三維生物打印的關鍵要素在于生物墨水的設計，傳統三維打印軟骨支架時，由于沒有活體細胞的存在，可選擇的打印方式較多，打印條件可較為苛刻，如冷凍、加熱、高強度光交聯等；傳統三維打印可選擇的打印墨水較為寬泛，如水凝膠的水相溶液、熱塑性高分子的有機溶液或熔融漿料；傳統三維打印可控制的打印墨水的參數自由度較大，可最大限度提高支架材料的濃度和黏度以獲取更加理想的結構成型效果。而三維生物打印由于生物墨水中活細胞的存在，為保持細胞的生物活性，可選擇的打印方式較少，生物墨水的制備和打印也需避免苛刻的環境；由于水凝膠十分接近天然細胞外基質(extracellular matrix, ECM),細胞可以在水凝膠內部存活，因此水凝膠是目前制備生物墨水的最主要材料 [ 17 , 18 ]。三維生物打印成型性能(與結構相關)和細胞活性(與功能相關)對于生物墨水的特性(如黏度、強度等)有著相反的要求，前者希望生物墨水有較高的濃度、交聯密度等，后者正好相反。由于單種水凝膠存在各自的缺陷，復合生物墨水體系已成為軟骨生物打印的主流。目前，三維生物打印技術還處于發展階段，適宜的生物墨水較少是限制其發展的重要原因之一，開發更多可供選擇的生物墨水是目前三維生物打印技術重要的研究方向 [ 19 , 20 ]。
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