三維打印在軟骨組織工程中的應用(2)
時間：2024-03-14 09:14 來源：南極熊 作者：于淑穎 李昱 程新好 閱讀：次
二、三維打印技術在關節軟骨的應用
（一)關節骨軟骨解剖結構和功能
骨軟骨組織構造精細且復雜，在解剖結構上關節軟骨與軟骨下骨互相連接，具有特定的骨軟骨單元結構梯度和生物學特性。骨軟骨界面是一個呈連續性變化的整體，由上而下軟骨組織具有不同的微觀解剖結構、力學特性以及生物學特性 [ 21 ]。在微觀解剖學中，關節軟骨自上而下可分為3層：關節軟骨層、鈣化軟骨層和軟骨下骨層( 圖2 )。其中關節軟骨層包括軟骨表層、中層和深層。關節軟骨層又稱透明軟骨層，透明軟骨層和鈣化軟骨層交界區被稱作潮線，它是嵌合在軟骨深層與鈣化軟骨層中的一個彼此交錯的三維結構，將較軟的透明軟骨組織與較硬的鈣化軟骨連接在一起。鈣化軟骨層和軟骨下骨層的交界區被稱作水泥線或粘合線，將兩側結構交錯結合錨定在一起。
關節軟骨層主要由水、ECM(主要是Ⅱ型膠原纖維)和軟骨細胞組成。膠原纖維直徑和方向、各層含水量、細胞形態和種類等由軟骨表層至深層逐漸發生變化。膠原纖維在軟骨表層直徑較細、排列密集、與關節表面相平行；在軟骨中層，直徑增粗、排列隨意；在軟骨深層，膠原纖維直徑進一步增粗、與關節表面相垂直，部分來自軟骨深層的粗大膠原纖維貫穿潮線將軟骨深層與鈣化軟骨層緊緊連接。含水量在軟骨表層最高，隨著深度的增加逐漸降低，軟骨深層含水量最低。由于含水量與滲透率呈正相關，軟骨深層滲透率最低，幾乎沒有液體能夠通過該組織，因此該層受到的界面剪切力也最大。
鈣化軟骨層是位于關節軟骨層與軟骨下骨層之間的一層鈣化骨組織，是一種天然界層結構。鈣化軟骨層軟骨細胞含量、含水量進一步降低，同時出現組織鈣化。軟骨的抗壓模量和抗壓強度從表層到深部逐漸增加，鈣化軟骨層形態致密，其硬度為關節軟骨層的10倍，為軟骨下骨層的1/60。在力學性能方面，鈣化軟骨層起承載多變剪切力、緩沖力以及連接作用，使得關節在運動時受的力學沖擊顯著降低，并且將關節軟骨的剪切力轉化為壓應力傳遞至軟骨下骨，大大降低了關節軟骨被壓碎和撕裂的可能性。另外，鈣化軟骨層有屏障作用，阻礙了關節軟骨層與軟骨下骨層之間的物質交換 [ 22 ]。
軟骨下骨層由水(約10%)、透明質酸、糖蛋白(Ⅰ型和Ⅴ型膠原、纖連蛋白和層粘連蛋白)和礦物質成分組成。軟骨下骨是高度血管化的生物礦化結締組織，大量的透明質酸和Ⅰ型膠原纖維為軟骨下骨提供了強大的抗壓強度和強大的硬度，與軟骨相比，軟骨下骨具有更高的壓縮模量和更低的彈性模量。
(二)三維打印技術方案
整體來看，關節軟骨自上而下含水率逐漸降低，蛋白多糖以及鈣化程度逐漸升高。正因為關節軟骨有很強的層次遞進性，從而導致了其具有獨特的生物學特性和結構復雜性 [ 23 ]。而三維打印技術逐層組裝的特點使得種子細胞、生物活性因子和生物材料在三維空間中可以精準排列分布 [ 24 ]。此外，由于軟骨損傷的同時往往伴有軟骨下骨的損傷，三維打印技術可用于制造具有細胞梯度及排列結構的軟骨支架，因此在構建雙相及多相仿生支架時具有極大優勢。目前常見的軟骨支架可分為離散型仿生支架和連續型仿生支架。離散型仿生支架又可分為單相支架、雙相支架和多相支架等 [ 25 ]。
單相支架由一種或多種材料制備而成，具有相同結構、成分、力學屬性，其單一的孔徑率和機械性能無法滿足關節軟骨漸變的組織結構和功能變化的要求。雙相支架通常具有軟骨相和骨相2層結構，且各分層在成分、結構、力學性能上更加接近軟骨組織結構，能夠一定程度上構建軟骨-骨一體化修復 [ 26 ]。Swieszkowski等 [ 27 ]使用了由纖維蛋白/PCL和PCL/PCL-磷酸三鈣相組成的雙相結構。這2個結構接種適當數量的細胞，分別用于軟骨和骨再生的成軟骨培養基和成骨培養基。最后，使用纖維蛋白膠將2個結構整合成1個構建體，可以清楚觀察到軟骨再生和新骨形成。但是雙相軟骨支架缺少了鈣化軟骨層，且支架置入后有支架斷裂等并發癥，所以三相及多相支架在軟骨-骨一體化修復中有更大優勢。三相及多相支架能夠更好地模擬出天然軟骨的分層結構及力學性能上的變化，從而構建出理想的仿生軟骨。Du等 [ 28 ]使用SLS技術制備了由PCL和透明質酸/PCL微球組成的多相骨軟骨支架，該仿生支架具有連續多層結構，模擬了從關節軟骨層到軟骨下骨層的梯度組成變化。結果表明，多相支架具有高度互連的孔隙率和理想的機械性能，以及優異的生物相容性。動物實驗的體內評估進一步證實，多相支架可成功誘導骨軟骨修復，新形成的組織表現出多種組織類型，包括關節軟骨和軟骨下骨。相較于離散型骨軟骨支架，連續型仿生軟骨支架顯著降低了支架分離等并發癥的發生，連續型仿生軟骨支架可將各層成分、結構、力學性能逐漸平穩過渡，通過一體化構造增強了支架的穩定性 [ 29 ]。Gao等 [ 30 ]通過雙氫鍵單體、N-丙烯酰甘氨酸酰胺(NAGA)和N-[三(羥甲基)甲基]丙烯酰胺(THMMA)共聚合成了高強度熱響應超分子共聚物水凝膠。NAGA/THMMA共聚單體水凝膠(PNT水凝膠)顯示出溫度敏感的可逆凝膠↔溶膠轉變和剪切減薄行為，因此可通過三維生物打印制備具有梯度成分(頂層加載轉化生長因子β1，底層結合β-磷酸三鈣)的連續型仿生軟骨支架，所得梯度支架保持高保真度和分辨率，具有高度互連的孔隙和理想的機械性能以及優異的生物相容性。此外，這種在不同層上印刷有轉化生長因子β1和β-磷酸三鈣的生物雜交梯度水凝膠的支架有助于體外人骨髓干細胞的附著、擴散、成軟骨和成骨分化。
三、三維打印技術在耳廓軟骨的應用
軟骨主要以3種形式存在于身體中：彈性軟骨、纖維軟骨和透明軟骨。盡管3種軟骨的特征都是高含水量和由軟骨細胞支撐、維持，但是其富含Ⅱ型膠原和糖胺聚糖的ECM之間存在顯著差異，因此每種類型的軟骨都具有不同的功能。例如，位于外耳和會厭的彈性軟骨具有富含彈性蛋白的ECM，該ECM為組織提供彈性，其主要功能是在重復彎曲時提供支撐，同時保持結構和形狀。在耳廓彈性軟骨中，由于不同部位的ECM含量分布不同，造成各部位力學性能的差異 [ 31 ]。耳軟骨ECM主要由蛋白多糖和彈性纖維構成，其中耳廓軟骨中央區域彈性纖維分布密集，周邊區域分布稀疏，因此耳廓中的耳屏、耳輪、對耳屏、對耳輪、耳甲和耳舟等亞單位結構( 圖3 )具有不同的力學性能，其中耳輪力學強度最低，對耳屏力學強度最高。耳廓軟骨無血管、低濃度的細胞以及固有的不增殖特性使該軟骨無法在功能、組織上自我愈合或再生 [ 32 ]。
先天性小耳畸形、耳廓外傷、耳廓術后、耳廓炎癥等各種原因可導致耳廓軟骨不同程度的缺損。耳廓軟骨缺損可影響其生理功能、顏面美觀，嚴重者可危及患者心理健康，因此耳廓軟骨缺損修復重建對提高患者生活質量具有重要意義。耳廓軟骨組織工程早在20年前已成功開展，Cao等 [ 33 ]將牛軟骨細胞接種在非織造聚乙醇酸網上，用海藻酸鈉模具通過溶劑澆鑄工藝將其進一步嵌入聚乳酸中，從而創造了人工耳。將構建體植入無胸腺小鼠皮下，12周后它們表現出新軟骨的大體組織學外觀。但是通過傳統工藝制造的耳軟骨支架在植入體內時發生坍塌，這也是此軟骨支架的致命弱點。發展與天然耳廓軟骨不同解剖分區的力學性能相適應、結構精細并可長期穩定于體內的耳軟骨支架，是組織工程耳軟骨研究和臨床轉化迫切需要解決的關鍵問題。
三維打印技術在制備復雜形狀和多種細胞類型的耳廓軟骨支架中廣泛應用。Xia等 [ 34 ]將明膠和透明質酸制備成水凝膠，并采用三維打印以確保外部三維形狀和內部孔隙結構的精確控制；其次，將甲基丙烯酸酐和光引發劑引入水凝膠系統，以使材料在三維打印期間可光固化；最后，采用冷凍干燥進一步提高機械性能并延長降解時間。通過整合光固化三維打印和冷凍干燥技術，以明膠和透明質酸成功地制成了人耳形狀的支架，與原始數字模型相比，這種支架的形狀相似程度超過90%。最重要的是，與軟骨細胞結合的支架在體外和自體山羊模型中成功地再生了具有典型腔隙結構和軟骨特異性ECM的成熟軟骨，這充分表明了光固化三維打印技術特別適合于制造具有精確、復雜、高質量、個性化的天然支架。Zopf等 [ 35 ]利用基于激光燒結的三維打印技術，以PCL作為耳廓重建的原材料，制備患者專用支架，結果顯示制備的耳廓支架具有高保真度和精細微孔結構，并支持軟骨再生。生物打印技術能夠精確沉積生物材料、種子細胞和生物因子，且允許支架內的材料和細胞發生變化。近年來，三維生物打印技術的發展推動了耳廓軟骨支架的進一步進展。Jang等 [ 36 ]以PCL和含有脂肪干細胞、軟骨細胞混合物的細胞負載藻酸鹽水凝膠為生物墨水，通過三維生物打印技術進行耳廓框架的精準構建，該耳廓支架具有高度的孔隙率、適當的孔徑、高度增強的機械性能，以及與天然耳廓軟骨相似的細胞梯度。用定量和定性方法評估體外細胞活力、增殖和分化，結果均表明，軟骨細胞、脂肪干細胞在三維支架中共培養后促進軟骨生成。此外，使用大鼠模型進行了體內組織學分析，顯示該耳廓支架在體內存活良好、無移位、無炎癥反應，并且可再生出相應區域的豐富的腔隙軟骨細胞和大面積的成熟軟骨。這些研究均表明，快速發展的三維打印技術使構建精細結構、與天然耳廓軟骨不同解剖分區力學性能相適應的天然仿生軟骨支架有望實現。
四、三維打印技術在鼻軟骨的應用
鼻是人類面部最突出的器官，包括支架結構、支撐系統及外覆組織。支架結構包括骨和軟骨，其由結締組織和韌帶連接到一起并發揮支撐作用。皮膚及軟組織覆蓋于其表面。先天性畸形、外傷、燒傷、鼻部術后均可導致鼻部軟骨缺損，極大影響患者的生活質量及心理健康。鼻部軟骨部分包括鼻中隔軟骨、鼻翼軟骨以及側鼻軟骨( 圖4 )，占據鼻部的2/3。鼻翼軟骨是構成鼻下部1/3的主要成分，其輪廓決定著鼻尖的固有特征，鼻翼軟骨與側鼻軟骨、鼻中隔軟骨之間的相互連接與鼻尖部的支撐、位置、輪廓密切相關，共同構建了鼻部重要的美學尺度。因此，鼻重建和鼻軟骨再生一直是一項艱巨的挑戰。過去20年中，組織工程取得了巨大進展，但大多數研究的結果都是形狀不規則的軟骨珠，不夠精確 [ 37 ]。
在鼻軟骨生物三維打印中，噴墨打印和擠出打印是最常用的技術，水凝膠作為一種含水量高的三維高分子網絡，其在結構上模擬ECM，為細胞生長提供"支架"，是生物三維打印常用的墨水材料 [ 44 ]。作為載體材料，水凝膠的性質決定了生物三維打印的成敗與質量，其需要具有良好的可打印性并能為細胞生長提供適宜微環境。然而，普通水凝膠的交聯網絡不夠均勻且缺乏能量耗散機制，機械性能較差，無法成為兼顧可打印性及生物相容性的"好用"生物墨水。理想的鼻軟骨支架要求具有長期的結構穩定性。為了補償水凝膠無法保持均勻的三維結構，納米纖維素/海藻酸鈉水凝膠作為一種新型生物墨水，結合了納米纖維素的剪切變稀行為和海藻酸鈉的快速交聯能力，具有強大的穩定性和整合性，目前廣泛用于鼻軟骨重建 [ 45 , 46 , 47 ]。Möller等 [ 46 ]應用這種新型生物墨水，基于擠出型三維生物打印技術，成功打印出鼻軟骨支架。該鼻軟骨支架在小鼠體內植入60 d后顯示出良好的機械穩定性，并觀察到糖胺聚糖產量和鼻軟骨細胞增殖的逐漸增加，免疫組化顯示出明顯的細胞增殖和人Ⅱ型膠原沉積，證實了三維生物打印的人細胞負載水凝膠構建體中的體內鼻軟骨的生成。Apelgren等 [ 45 ]同樣使用納米纖維素、藻酸鹽與人軟骨細胞、人間充質干細胞結合，使用三維擠出式生物打印機制造構建體(5.0 mm×5.0 mm×1.2 mm)。生物打印后立即將構建體植入48只裸鼠的背部皮下，分別在30和60 d后進行形態學和免疫組織化學檢查，結果顯示構建體中的人鼻軟骨細胞顯示出良好的增殖能力，60 d后17.2%的表面積被增殖的軟骨細胞覆蓋。在包含軟骨細胞和干細胞混合物的構建體中，可觀察到軟骨細胞合成的糖胺聚糖和Ⅱ型膠原含量增加。該研究表明，三維生物打印是一種有前途的人類軟骨制作技術。此外，為了再現鼻軟骨的多層異質結構并實現整個鼻再生，Jodat等 [ 48 ]用集成生物傳感系統打印了雙生物墨水的鼻狀結構。該構建體由多層軟質和硬質生物墨水組成，在生物相容性條件下實現氣味感知，軟骨細胞負載的三維生物打印軟骨樣結構帶有電子嗅覺模擬生物傳感器。由甲基丙烯酰化水凝膠和聚乙二醇二甲基丙烯酸酯組成的光交聯水凝膠生物墨水可以通過調節生物墨水的機械性能，形成一個機械穩定性強、生物相容度高的三維微環境，以支持軟骨細胞的生長和分化。因此，可以優化由不同濃度水凝膠組成的具有硬、軟機械性能的2種不同生物墨水，以模擬鼻軟骨中天然ECM的機械性能，從而允許鼻軟骨組織的形成。
五、未來與展望
綜上所述，骨軟骨組織結構非常復雜，骨軟骨缺損的再生仍然是組織工程和整形外科的一個巨大挑戰。目前，已經通過三維打印技術獲得了軟骨(關節軟骨、半月板、椎間盤、耳廓、鼻)的三維模型和支架。然而，在制備各向異性軟骨的功能構建體方面仍存在一些挑戰。由于關節軟骨、半月板和椎間盤位于人體的承重部位，因此其軟骨支架需要具備一定機械強度。耳廓、鼻等軟骨為防止植入后的吸收、變性和鈣化，不僅需要一定的彈性，也需要一定的機械強度 [ 48 ]。在組織再生和修復期間，組分的區域梯度(如不同的細胞和生物活性分子)和結構區域梯度(如不同的孔徑、微結構和材料硬度)影響細胞增殖、遷移和分化，以及構建體的機械性能。因此，探索如何制造不同的軟骨結構和仿生梯度非常重要。傳統三維打印技術可一定程度上模擬體內軟骨的結構生理特點，但三維生物打印技術通過使用CAD/CAM技術的空間和時間控制沉積來實現外部形狀、內部孔隙率、活性細胞分布的精確控制，從而為仿生軟骨的制備提供更好的解決方案。但三維生物打印技術尚不成熟，需要進一步提高分辨率和準確性。當前我們應該聚焦于改進三維打印技術和支架材料，制造具有適當生物力學特性的構建體，并通過印刷來保證較高的細胞存活率和生物分子活性，才能確保仿生組織和器官的構建。軟骨組織工程的發展趨勢是將天然材料與合成材料相結合，以充分發揮各自的優勢。目前已經成功開發許多共聚物，有望成為軟骨重建的理想材料。選擇具有適當生物力學特性、生物相容性和表面形態的支架是促進軟骨形成的關鍵，科學家需要繼續努力。
目前，四維打印和智能材料的出現為軟骨組織工程打開了新渠道。四維打印特指對智能材料的三維打印制造。相較于傳統的三維打印，四維打印增加了"時間"這一維度，它使得所打印物體的物理特性(例如形狀、顏色、尺寸等)能夠響應外界刺激(諸如溫度、光、有機溶劑、濕度等) [ 49 ]。四維打印通過給靜態打印結構賦予動態屬性，在熱、光、pH、水分、電和磁場等各種刺激下，打印物體的形狀和(或)屬性隨著時間的推移會發生變化，從而可以將材料的三維打印加工拓展到復雜幾何形狀之外。近年來，隨著智能材料和新型打印方法的快速發展，大大擴大了四維打印的范圍 [ 50 , 51 ]。智能生物材料可以調節細胞行為，提供良好的組織修復和再生微環境，從而誘導軟骨修復和再生。這一過程通過被動響應外源或內源性刺激，調整材料的結構和功能，以接近于天然軟骨；或者通過主動提供生理生化、物理信號因子，來控制藥物或生物活性因子的釋放調節此過程。應用智能生物材料構建能夠與細胞和生物活性因子結合的軟骨組織工程支架，被認為是軟骨修復和再生的有效和有前途的策略。然而，目前臨床上使用的智能生物材料很少。事實上，只有5%的生命科學發現從學術環境中最終轉化用于臨床、新藥、診斷或設備。因此，臨床需求必須是開發用于關節軟骨修復和再生的智能生物材料的基礎。生物材料，甚至是惰性生物材料，可以改善與細胞和組織的相互作用，并通過先進的制造技術獲得智能 [ 52 ]。科學家們更應該使智能生物材料與先進的制造技術(三維、四維打印技術)相結合，推進軟骨組織工程的進展。
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